不同儲(chǔ)存條件和反復(fù)凍融對(duì)血清和血漿乙酰膽堿受體抗體水平的影響

郝洪軍 洪宇 謝琰臣 李海峰

不同儲(chǔ)存條件和反復(fù)凍融對(duì)血清和血漿乙酰膽堿受體抗體水平的影響

郝洪軍 洪宇 謝琰臣 李海峰

目的 探討不同儲(chǔ)存條件和反復(fù)凍融對(duì)血清和血漿乙酰膽堿受體抗體（ACh RAb）水平的影響。方法 將1例重癥肌無(wú)力患者的血清和血漿標(biāo)本分成數(shù)等份，置于不同儲(chǔ)存條件下（常溫、4℃或—80℃）并經(jīng)過(guò)不同次數(shù)的凍融，不同等分的樣本使用同一批次商品化ELISA試劑盒雙平行孔檢測(cè)AChRAb水平。計(jì)算各種條件下血清和血漿標(biāo)本ACh RAb抑制率的變異系數(shù)（），比較不同處理?xiàng)l件下的抑制率以及同一條件下血清和血漿標(biāo)本的抑制率。結(jié)果 除常溫條件下血漿標(biāo)本＞10%外，其余條件下均＜10%。4℃條件下血清AChRAb的抑制率顯著高于其他條件下血清的抑制率（＜0.05），4℃和常溫條件下血漿的抑制率顯著低于其他條件下血漿標(biāo)本的抑制率（＜0.05）。4℃條件下血清和血漿標(biāo)本ACh RAb抑制率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05），而冷凍保存后經(jīng)過(guò)多達(dá)5次凍融兩者的抑制率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）。結(jié)論 —80℃直接儲(chǔ)存的血清和血漿標(biāo)本，即使經(jīng)過(guò)多次凍融，ACh RAb水平檢測(cè)結(jié)果仍可較為一致。血清標(biāo)本在常溫、4℃或冷凍保存，血漿標(biāo)本低溫冷凍保存，數(shù)日內(nèi)完成檢測(cè)結(jié)果具有一致性。

重癥肌無(wú)力；乙酰膽堿受體抗體；儲(chǔ)存條件；凍融

乙酰膽堿受體抗體（anti-acetylcholine receptor antibody，ACh RAb）是重癥肌無(wú)力（myasthenia gravis，MG）的主要的生物標(biāo)志物，AChRAb檢測(cè)在MG的診斷和療效評(píng)價(jià)具有重要價(jià)值［1］。傳統(tǒng)的ACh RAb檢測(cè)方法是放射免疫沉淀法，ELISA法因其無(wú)放射性和容易開(kāi)展而應(yīng)用日漸廣泛，目前已有商品化的ELISA試劑盒應(yīng)用于臨床。目前，國(guó)內(nèi)只有少數(shù) MG診治中心能夠檢測(cè)ACh RAb，待測(cè)標(biāo)本經(jīng)常需要在常溫或4℃環(huán)境運(yùn)送至MG診療中心；研究所用標(biāo)本通常于—80℃環(huán)境凍存后進(jìn)行批量檢測(cè)，標(biāo)本可能會(huì)經(jīng)過(guò)重復(fù)檢測(cè)及反復(fù)凍融。而且，有時(shí)只有血漿標(biāo)本可供檢測(cè)，然而該ELISA試劑盒要求使用血清標(biāo)本。目前尚缺乏血清/血漿中ACh RAb水平在不同溫度環(huán)境下穩(wěn)定性的研究，凍融對(duì)ACh RAb水平的影響亦未曾充分評(píng)估，血清和血漿標(biāo)本采用ELISA法檢測(cè)的結(jié)果是否存在差異也無(wú)相關(guān)研究。基于以上問(wèn)題，本文作者將1例MG患者的血清和血漿標(biāo)本分成數(shù)等份，同時(shí)分別置于不同儲(chǔ)存條件下并經(jīng)過(guò)不同次數(shù)凍融，對(duì)該ELISA試劑盒檢測(cè)的ACh RAb水平進(jìn)行比較。

1 對(duì)象和方法

1.1 觀察對(duì)象 標(biāo)本采集自1例25歲男性Ⅱb型MG患者，其MG病史3個(gè)月，無(wú)其他疾病病史。該患者的肌無(wú)力癥狀從眼外肌開(kāi)始逐漸累及面部和肢體肌肉，標(biāo)本采集時(shí)的QMG評(píng)分為10分。篩查未發(fā)現(xiàn)合并感染及其他自身免疫病。胸部CT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)胸腺瘤，標(biāo)本采集前已行胸腺切除，病理示B2型胸腺瘤。標(biāo)本采集前未行免疫治療?；颊咭阎橥?。

1.2 方法 患者于上午10點(diǎn)左右在神經(jīng)科門診采集血液標(biāo)本（不要求空腹）10 m L，采集試管為標(biāo)準(zhǔn)真空血清試管和標(biāo)準(zhǔn)真空EDTA抗凝試管，于室溫（20℃）于1800 r/min離心（離心半徑13.5 cm）8 min后留取血清，于3000 r/min離心（離心半徑13.5 cm）8 min后留取血漿。所有步驟均于半無(wú)菌條件下完成。

血清和血漿標(biāo)本均分成多個(gè)相同的小份。每種條件（表1）均檢測(cè)血清和血漿同樣的小份標(biāo)本，以觀察儲(chǔ)存和凍融條件對(duì)檢測(cè)結(jié)果一致性的影響，比較血清和血漿標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果的一致性。每種條件均檢測(cè)3小份標(biāo)本，以減少操作帶來(lái)的偶然誤差的影響。每份標(biāo)本均按照ACh RAb試劑盒（RSR Ltd.，Cardiff，UK）的說(shuō)明書用酶標(biāo)儀（BIORAD-Model 680）進(jìn)行平行孔檢測(cè)［2］。對(duì)每小份標(biāo)本計(jì)算其兩平行孔抑制率的均值，作為該小份標(biāo)本的抑制率。抑制率=100×﹝1—（λ）標(biāo)本/（λ）陰性對(duì)照﹞。計(jì)算每種處理?xiàng)l件下3小份標(biāo)本抑制率的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，以及該條件下結(jié)果的變異系數(shù)（coefficient of variability，），=（標(biāo)準(zhǔn)差/平均值）×100，可以反映檢查結(jié)果的穩(wěn)定性（批內(nèi)聚集性）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 不同處理?xiàng)l件下（5組）抑制率比較采用單因素方差分析（ANOVA），判斷不同保存條件對(duì)結(jié)果一致性的影響。對(duì)總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義者，運(yùn)用最小顯著性差異法（least significant difference，LSD）進(jìn)一步進(jìn)行多重比較。同一處理?xiàng)l件下的血清和血漿標(biāo)本的抑制率比較采用配對(duì) 檢驗(yàn)，以評(píng)價(jià)血清和血漿標(biāo)本結(jié)果的一致性。以＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

各種條件下的血清或血漿ACh RAb的抑制率值見(jiàn)表1。除了血漿標(biāo)本在E條件外，其余各條件下各標(biāo)本AChRAb抑制率的均小于10%。在不同條件下血清標(biāo)本ACh RAb抑制率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05），進(jìn)一步分析顯示D條件下抑制率高于其余條件。血漿標(biāo)本ACh RAb的抑制率在不同條件下差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05），進(jìn)一步分析顯示D和E條件下的抑制率低于其余條件（＜0.05）。

表1 不同儲(chǔ)存條件和凍融次數(shù)對(duì)血清/血漿AChRAb抑制率的影響 （=3）

表1 不同儲(chǔ)存條件和凍融次數(shù)對(duì)血清/血漿AChRAb抑制率的影響 （=3）

注：與條件E比較，*＜0.05；與條件D比較，#＜0.05；值、值為血清和血漿標(biāo)本結(jié)果比較所得

處理?xiàng)l件 血清均值 標(biāo)準(zhǔn)差血漿均值 標(biāo)準(zhǔn)差值值A(chǔ) —80℃保存8 d 62.9#4.57 7.3 60.3*#2.3 3.8 0.69 0.560 B —80℃保存8 d，分別于第1、3和5天溶解1次，每次均于4℃保存1 h后再次冷凍62.1#1.85 3 60.1*#3.13 5.2 1.74 0.224 C 在—80℃保存8 d，分別于第1、2、3、5和7天溶解1次，每次均于4℃保存1 h后再次冷凍59.4#5.07 8.5 60.8*#3.75 6.2—0.76 0.528 D 4℃保存8 d69.4*1.44 2.1 51.7 3.69 7.1 6.69 0.021 E 室溫保存8 d 62 3.23 5.2 47.8 6.95 14.6 2.52 0.128

同一條件下血清和血漿標(biāo)本抑制率除D條件血清標(biāo)本抑制率高于血漿標(biāo)本（＜0.05）外，其余處理?xiàng)l件下差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

3 討論

本研究所用標(biāo)本為來(lái)自同一患者的同一標(biāo)本，以期在其他方面相同的情況下觀察保存條件對(duì)AChRAb檢測(cè)結(jié)果一致性的影響，以及血清和血漿標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果的一致性。血清或血漿標(biāo)本均含有降解酶，在4℃、室溫或低溫儲(chǔ)存條件下，標(biāo)本中的蛋白類分子的降解程度可能存在不同，導(dǎo)致抗體蛋白含量減少和/或結(jié)合能力下降。血清和血漿的主要區(qū)別在于血漿含有豐富的纖維蛋白原，對(duì)一些生物分子有黏附作用，黏附的生物分子可能影響抗體的穩(wěn)定性和/或結(jié)合能力。

2010年，Hewer等［3］提出了一種新的ELISA方法，其特異性和敏感性與放射免疫沉淀法相近。該方法原理是將純化的胎兒型和成人型ACh R混合物包被在酶標(biāo)板，待測(cè)血清中的ACh RAb與幾種不同的AChR單克隆抗體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合AChR。待測(cè)血清中ACh RAb濃度越高，其對(duì)生物素標(biāo)記的AChR單克隆抗體結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)性抑制越強(qiáng)，因此可以用抑制率反映ACh RAb的水平。由于該方法方便可靠且逐漸普及，本文作者采用該ELISA試劑盒檢測(cè)ACh RAb，初步觀察不同保存條件對(duì)ACh RAb檢測(cè)結(jié)果一致性的影響，以及對(duì)血清和血漿標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果的一致性的影響。

本實(shí)驗(yàn)標(biāo)本檢測(cè)所得到的AChRAb抑制率均顯著高于16%的陽(yáng)性界值，也低于本研究所用ELISA試劑盒說(shuō)明書中標(biāo)準(zhǔn)曲線的高限［2］。大部分處理?xiàng)l件下小于10%，即使直接儲(chǔ)存于—80℃并在隨后反復(fù)凍融多達(dá)5次的標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果也較為一致。然而，常溫放置8 d的血漿標(biāo)本的超過(guò)10%。有研究報(bào)道，在不同儲(chǔ)存條件和反復(fù)凍融后檢測(cè)血清中水通道蛋白4抗體（antiaquaporin-4 antibody，AQP4Ab）水平，發(fā)現(xiàn)常溫運(yùn)送標(biāo)本和經(jīng)過(guò)反復(fù)凍融并未使血清中AQP4抗體的穩(wěn)定性降低［4］。本實(shí)驗(yàn)除了4℃保存血清標(biāo)本的抑制率略偏高外，其余處理?xiàng)l件下血清抑制率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因?yàn)樵摋l件下的很小，而其余4種條件下的中有些較大，推測(cè)該條件下結(jié)果偏高可能是由于偶然誤差所致。血清標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果提示血清標(biāo)本在常溫或4℃保存8 d后其抗體水平均能保持相對(duì)穩(wěn)定，抗體水平亦未受到標(biāo)本冷凍后反復(fù)凍融的影響。

本實(shí)驗(yàn)血漿標(biāo)本在D和E處理?xiàng)l件下的抑制率較其余3種條件下低，而A、B和C條件下差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。當(dāng)血漿標(biāo)本儲(chǔ)存于4℃或常溫時(shí)，前述機(jī)制使AChRAb穩(wěn)定性下降的原因可能是D和E條件下抑制率低。血清和血漿標(biāo)本結(jié)果的絕對(duì)差在D和E條件下較大，導(dǎo)致無(wú)法使用常溫或4℃保存的血漿標(biāo)本代替血清標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。而直接保存于—80℃的血清和血漿標(biāo)本即使經(jīng)過(guò)多達(dá)5次凍融，其ACh RAb水平檢測(cè)結(jié)果差異也無(wú)明顯變化。

本研究結(jié)果提示，臨床檢測(cè)ACh RAb水平時(shí)，血清標(biāo)本可在常溫、4℃或冷凍保存，血漿標(biāo)本需要冷凍保存，檢送標(biāo)本前先分離血清或血漿且于采血后數(shù)日內(nèi)完成檢測(cè)均可得到可靠結(jié)果。而且，血清和血漿標(biāo)本在—80℃保存即使經(jīng)過(guò)多達(dá)5次凍融也可以保持檢測(cè)AChRAb水平穩(wěn)定，在實(shí)驗(yàn)室研究中需要成批檢測(cè)ACh RAb水平時(shí)使用冷凍的血漿標(biāo)本代替血清標(biāo)本可以獲得較為一致的結(jié)果。

［1］Gomez AM，Van Den Broeck J，Vrolix K，et al.Antibody effector mechanisms in myasthenia gravis-pathogenesis at the neuromuscular junction［J］.Autoimmunity，2010，43（5-6）：353-370.

［2］AChRAb ELISA Kit（96 wells）［EB/OL］.http：//www. rsrltd.com/IFU.html.

［3］Hewer R，Matthews I，Chen S，et al.A sensitive nonisotopic assay for acetylcholine receptor autoantibodies［J］.Clin Chim Acta，2006，364（1-2）：159-166.

［4］Jarius S，Wildemann B.Effect of storage conditions and freeze/thaw cycles on aquaporin-4 antibody（NMO-IgG）serum levels［J］.Clin Chem Lab Med，2011，49（12）：2121-2122.

LI Hai-feng，Email：drlhf@163.com

Objective To evaluate the intra-assay reproducibility of anti-acetylcholine receptor antibody（ACh RAb）level in serum and plasma samples among various pre-treatment conditions consisting of different storage schemes and subsequent freeze/thaw cycles.Methods The serum and plasma samples were collected from a patient with myasthenia gravis and allocated in aliquots pre-treated in various conditions（stored at room temperature［RT］，4℃or—80℃with subsequent freeze/thaw cycles）.Each aliquot was examined in duplicate with commercial ACh RAb ELISA kit.The coefficient of variability（）was calculated for inhibition rate of AChRAb in each pre-treatment condition.Inhibition rates of AChRAb in serum or plasma samples were compared among each condition，and compared between serum and plasma samples in each condition.Results Except for plasma sample at RT，thes of all the other samples in various conditions were＜10%。The inhibition rate of AChRAb in serum sample was significantly higher at 4℃than those in other conditions（＜0.05）.The inhibition rate in plasma samples were significantly higher at 4℃and RT than those in other conditions（＜0.05）.There were significant difference in inhibition rates between serum and plasma samples at 4℃（＜0.05），while no difference was found in frozen conditions with up to five subsequent freeze/thaw cycles（＞0.05）.Conclusions There was good intra-test reproducibility of the ELISA kit in determining the AChRAb levels in serum and plasma samples stored at—80℃directly with various subsequent freeze/thaw cycles.There was good intra-test reproducibility in serum samples stored at RT，4℃and frozen conditions and in plasma samples stored in frozen conditions，which were examined in several days after blood collection.

myasthenia gravis；acetylcholine receptor antibody；storage condition；freeze/thaw

R746.1

：A

：1006-2963（2014）06-0394-03

2013-08-09）

（本文編輯：鄒晨雙）

10.3969/j.issn.1006-2963.2014.06.004

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81070963，30700242）；山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（ZR2010HM019）

100034北京大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科神經(jīng)免疫室（郝洪軍）；266003青島大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（洪宇）；100050首都醫(yī)科大學(xué)友誼醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（謝琰臣）；250012山東大學(xué)齊魯醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（李海峰）

李海峰，Email：drlhf@163.com