膠紅酵母JB401降解脫色三苯甲烷類染料

李國(guó)輝，高劍平，丁重陽(yáng)，劉元法，張 梁，顧正華，石貴陽(yáng)，章克昌

(1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無(wú)錫 214122;2.江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，無(wú)錫 214122;3.漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，漳州 363000;4.江南大學(xué) 食品學(xué)院，無(wú)錫 214122)

三苯甲烷類染料廣泛地應(yīng)用于紡織印染、造紙和制革等工業(yè)中［1－3］，近期研究發(fā)現(xiàn)結(jié)晶紫(圖1)等三苯甲烷類染料對(duì)動(dòng)物細(xì)胞具有毒害作用，因此有必要研究該類染料的脫色降解處理。一些物理和化學(xué)方法雖然也可以用于染料的處理，但由于其代價(jià)高、污泥產(chǎn)生量多和二次污染等原因，限制了其在工業(yè)中的應(yīng)用［4－6］。利用微生物處理染料具有無(wú)污染、耗能低、代價(jià)小和可持續(xù)性好等優(yōu)點(diǎn)［7］，因此篩選出對(duì)三苯甲烷類染料具有降解脫色能力的微生物，研究微生物降解染料的機(jī)制，對(duì)三苯甲烷類染料污染治理具有重要意義。

諸多微生物都具有降解脫色三苯甲烷類染料的能力，如細(xì)菌 Agrobacterium radiobacter MTCC 8161［8］和 Bacillus cereus DC11［9］完全脫色 10 mg/L的結(jié)晶紫分別需要8和24 h，絲狀真菌 Trametes sp.SQ01 6 d內(nèi)可脫色20 mg/L結(jié)晶紫30%以上［10］，酵母 Saccharomyces cerevisiae MTCC 463 在7 h內(nèi)可脫色100 mg/L孔雀石綠85%以上［7］。在細(xì)菌、酵母和絲狀真菌中，酵母脫色三苯甲烷染料的能力較強(qiáng)，但是到目前為止，利用酵母脫色三苯甲烷類染料的研究較少，因此考慮篩選酵母來(lái)脫色三苯甲烷類染料。

筆者在煙梗樣品中分離篩選獲得1株高效脫色結(jié)晶紫的菌株，經(jīng)ITS-5.8S rDNA鑒定后發(fā)現(xiàn)該菌株為膠紅酵母。在初步確定脫色機(jī)理后，考察不同培養(yǎng)條件對(duì)膠紅酵母降解脫色結(jié)晶紫的影響，以期為其在生物降解化工廢水方面的應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

圖1 3種三苯甲烷染料的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of three triphenylmethane dyes

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

膠紅酵母(Rhodotorula mucilaginosa)JB401，篩選自四川地區(qū)產(chǎn)煙梗中。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L):NaCl 5，酵母膏5，蛋白胨10;pH 7。

脫色培養(yǎng)基(g/L):NaCl 5，酵母膏5，蛋白胨10，結(jié)晶紫0.05;pH 7。

以上培養(yǎng)基均在115℃下滅菌20 min，斜面在30℃下培養(yǎng)48 h后放入4℃冰箱保存，使用時(shí)用接種環(huán)取1環(huán)菌放入種子培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)24 h后待用。

1.2 方法

1.2.1 脫色微生物的分離篩選與鑒定

稱取2 g煙梗樣品，加入98 mL無(wú)菌生理鹽水，放入250 mL無(wú)菌三角瓶中，在30℃、150 r/min的搖床上培養(yǎng)1 h后，將培養(yǎng)液分別稀釋104、105或106倍后涂布在水溶苯胺藍(lán)平板上，并通過(guò)連續(xù)的分離純化篩選出能夠產(chǎn)生穩(wěn)定、明顯、較大透明圈的菌落(透明圈直徑與菌落直徑比值越大越好)，斜面保藏。

將斜面保藏的菌種轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基中，30℃、150 r/min培養(yǎng)，24 h后分別加入不同濃度的結(jié)晶紫，通過(guò)測(cè)定不同菌株對(duì)結(jié)晶紫的脫色率，從中篩選出脫色能力優(yōu)良的菌株，保藏后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

按照Guillamm等［11］的方法對(duì)篩選得到的菌株進(jìn)行ITS-5.8S rDNA序列擴(kuò)增，所用引物ITS1:5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。將 PCR產(chǎn)物連接到載體pMD18T，轉(zhuǎn)化感受態(tài)JM109，提取質(zhì)粒，擴(kuò)增得到的ITS-5.8S rRNA基因利用ABI 3130 DNA自動(dòng)序列分析儀在上海生工生物工程公司進(jìn)行測(cè)序，并在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索進(jìn)行同源性分析。最后利用ClustalX和Mega 5軟件制作進(jìn)化樹(shù)。

1.2.2 全波長(zhǎng)掃描

統(tǒng)計(jì)并記錄所有患者診斷結(jié)果，比較CT掃描，增強(qiáng)MRI的診斷效能，計(jì)算CT掃描和增強(qiáng)MRI以及兩者聯(lián)合應(yīng)用診斷的、敏感度、特異度和準(zhǔn)確性。

收集膠紅酵母脫色完全后的結(jié)晶紫培養(yǎng)液，8 000 r/min離心20 min去除沉淀，上清液中加入等體積乙酸乙酯萃取，用無(wú)水Na2SO4干燥后，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干，獲得的結(jié)晶用少量色譜級(jí)甲醇溶解，使其終質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL，對(duì)照為不加入膠紅酵母的結(jié)晶紫培養(yǎng)基［12］，對(duì)脫色前后的染料在200～900 nm波長(zhǎng)范圍進(jìn)行掃描，獲取的數(shù)據(jù)用UV-solutions1.2(日立集團(tuán))處理。

1.2.3 脫色實(shí)驗(yàn)

將生長(zhǎng)24 h的種子按2%比例接種于脫色培養(yǎng)基中，30℃、150 r/min培養(yǎng)24 h后，加入50 mg/L結(jié)晶紫，每隔1 h取出一定量的樣品，與無(wú)水乙醇按體積比1∶2的比例(V(樣品)∶V(無(wú)水乙醇))混勻后，12 000 r/min離心5 min，利用分光光度法在染料的最大吸收峰處測(cè)定上清液中剩余染料的含量，并以不接種的染料培養(yǎng)基作為對(duì)照來(lái)測(cè)定染料的脫色率［13－14］。每組3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，脫色率按式(1)來(lái)計(jì)算。

式中:I為對(duì)照在最大吸收峰處的吸光值;F為某一時(shí)刻樣品在最大吸收峰處的吸光值。

在此條件下，依次分別對(duì)pH 4～11、溫度(20～45)℃、接種量0.1% ～8%、培養(yǎng)方式(搖床和靜置)、初始染料質(zhì)量濃度(25～200)mg/L進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，確定膠紅酵母對(duì)結(jié)晶紫脫色的最優(yōu)條件。

2 結(jié)果與討論

2.1 脫色微生物的分離篩選與鑒定

從煙梗樣品中一共篩選到20株能夠在苯胺藍(lán)平板上產(chǎn)生透明圈的微生物，復(fù)篩后發(fā)現(xiàn)其中4株可以明顯降解結(jié)晶紫，4株中菌株JB401脫色效果最好，因此以JB401為出發(fā)菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

經(jīng)過(guò)ITS-5.8S rDNA序列測(cè)定及GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知:菌株 JB401與Rhodotorula mucilaginosa strain ATCC 66034(EU853846.1)相似性達(dá)到100%，由紅酵母屬ITS-5.8S rDNA序列構(gòu)建的N-J型進(jìn)進(jìn)化樹(shù)中(圖2)，菌株JB401與R.mucilaginosa strain ATCC 66034(EU853846.1)和 R.mucilaginosaCBS9078(AF444655.1)親緣關(guān)系最近，因此命名為Rhodotorula mucilaginosa JB401。

圖2 JB401系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 The phylogenetic tree of JB401

2.2 全波長(zhǎng)掃描分析

利用膠紅酵母對(duì)結(jié)晶紫脫色后，將培養(yǎng)液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知:在589 nm處的最大吸收峰 λmax消失。而 Lee等［15］利用Pseudomonas otitidis WL-13降解結(jié)晶紫時(shí)發(fā)現(xiàn)，離心后上清液為無(wú)色，而菌體沉淀為紫色，認(rèn)為該菌株對(duì)結(jié)晶紫的脫色主要是菌體的吸附作用。在本實(shí)驗(yàn)中，脫色后離心得到的菌體沉淀不顯紫色，同時(shí)結(jié)晶紫脫色后在紫外區(qū)形成諸多小峰，表明有新的小分子產(chǎn)物生成，因此說(shuō)明膠紅酵母對(duì)結(jié)晶紫的脫色并不是由于膠紅酵母的菌體吸附作用，而是由菌體的降解作用引起的。類似結(jié)果在Staphylococcus epidermidis降解結(jié)晶紫、孔雀石綠等三苯甲烷類染料過(guò) 程 中 也 有 報(bào) 道［16－17］。 此 外，Agrobacterium radiobacter MTCC 8161可利用漆酶的脫甲基和去苯環(huán)能力作用于結(jié)晶紫［8］，使之分解為多種小分子物質(zhì)，并在全波長(zhǎng)掃描中產(chǎn)生新峰［18］，這一現(xiàn)象也與R.mucilaginosa JB401降解結(jié)晶紫相似。

圖3 全波長(zhǎng)掃描結(jié)晶紫降解前后變化Fig.3 UV-VIS spectral analysis before and after crystal violet degradation

2.3 初始pH對(duì)膠紅酵母脫色的影響

圖4為初始pH對(duì)膠紅酵母脫色的影響結(jié)果。由圖4可知:膠紅酵母對(duì)結(jié)晶紫的脫色效果在酸性范圍較好，在pH 4～7之間脫色率可以保持在86%以上，其中pH 5時(shí)脫色率最高，分別為94.08%。當(dāng)pH＞7時(shí)，隨pH的增加脫色率急劇降低，當(dāng)pH為10時(shí)脫色率僅為21.97%。

圖4 pH對(duì)結(jié)晶紫脫色的影響Fig.4 Effects of pH on decolorization of crystal violet

這與前人的研究結(jié)果不同，可能是因?yàn)椴煌奈⑸飳?duì)不同的染料脫色的最適pH各有不同。如，黃孢原毛平革菌對(duì)甲基紫的最適脫色pH為4.5，pH增加或降低均對(duì)黃孢原毛平革菌的脫色產(chǎn)生明顯影響，當(dāng)pH從3增加到7時(shí)，黃孢原毛平革菌對(duì)甲基紫的脫色率降低了 75%［19］，Trametes sp.SQ01產(chǎn)生漆酶脫色Remazol Brilliant Blue R時(shí)，也得到了相似的結(jié)果［20］。由此可見(jiàn)，膠紅酵母在偏酸性pH范圍內(nèi)有較高的脫色能力，這一特點(diǎn)符合生物處理廢水的要求。

2.4 溫度對(duì)膠紅酵母脫色的影響

考察不同的溫度對(duì)結(jié)晶紫脫色影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知:在20和45℃時(shí)，膠紅酵母對(duì)結(jié)晶紫脫色率仍高于80%，分別為81.17%和85.50%;其中，在37℃時(shí)，脫色效率最高，達(dá)到93.10%。當(dāng)溫度低于37℃時(shí)，脫色率隨溫度升高逐漸升高，超過(guò)45℃后，隨溫度升高脫色率則下降。

Phanerochaete chrysosporium對(duì)結(jié)晶紫的最適脫色溫度是(35±1)℃，當(dāng)溫度升高或降低時(shí)，會(huì)影響到染料的脫色率，這可能是由于生成的過(guò)氧化物酶減少或者酶失活造成脫色能力的降低［19］。對(duì)于純化后的真菌漆酶也是如此，在一定范圍內(nèi)，當(dāng)溫度升高時(shí)，由于酶與底物間反應(yīng)速率加快導(dǎo)致單位時(shí)間內(nèi)脫色率升高，但是當(dāng)溫度超過(guò)一定值后，由于酶的失活引起脫色率降低［20］。

圖5 溫度對(duì)結(jié)晶紫脫色的影響Fig.5 Effects of temperature on decolorization of crystal violet

2.5 接種量對(duì)膠紅酵母脫色的影響

圖6為接種量對(duì)膠紅酵母脫色的影響結(jié)果。由圖6可知:當(dāng)接種量小于2%時(shí)，脫色效率均隨接種量的升高而升高;當(dāng)接種量為0.1%時(shí)，脫色率僅為23.44%;當(dāng)接種量為2%時(shí)，脫色率為90.13%;當(dāng)接種量大于等于2%時(shí)，結(jié)晶紫的脫色率保持穩(wěn)定，并保持在90%以上。

而在Candida krusei脫色過(guò)程中，最適接種量為5%;超過(guò)5%時(shí)并不會(huì)影響達(dá)到最大脫色率的時(shí)間;但小于5%時(shí)，達(dá)到最大脫色率的時(shí)間會(huì)有所延遲，如接種量為3%時(shí)，則延長(zhǎng)了24 h［21］。這可能是由于當(dāng)接種量較少時(shí)，菌體量較少不足以產(chǎn)生足夠的酶來(lái)處理染料，且染料對(duì)菌體具有一定的毒性而抑制菌體生長(zhǎng)，所以造成了脫色時(shí)間的延長(zhǎng)。這一結(jié)果在利用Saccharomyces cerevisiae降解孔雀石綠的研究中也得到了證實(shí)［7］。

圖6 接種量對(duì)結(jié)晶紫脫色的影響Fig.6 Effects of inoculum ratio on decolorization of crystal violet

2.6 培養(yǎng)方式對(duì)膠紅酵母脫色的影響

考察不同培養(yǎng)方式對(duì)膠紅酵母脫色的影響，結(jié)果見(jiàn)圖7。由圖7可知:搖床培養(yǎng)時(shí)脫色效率較高。在靜置條件下，膠紅酵母培養(yǎng)4 h時(shí)脫色率達(dá)到91.85%;而搖床培養(yǎng)2 h后，脫色率即達(dá)90.00%。在脫色的前5 h，搖床脫色一直明顯優(yōu)于靜置脫色，但是5 h后二者幾乎無(wú)差異(圖7)。

圖7 培養(yǎng)方式對(duì)結(jié)晶紫脫色的影響Fig.7 Effects of culture condition on decolorization of crystal violet

Conway等［22］研究發(fā)現(xiàn)，幾乎未見(jiàn)利用酵母和絲狀真菌在厭氧條件下對(duì)染料進(jìn)行脫色，這可能是因?yàn)樵趨捬鯒l件下，菌體的生長(zhǎng)和代謝都受到較大影響，進(jìn)而影響到染料的脫色和降解。然而，膠紅酵母在對(duì)結(jié)晶紫染料脫色時(shí)，對(duì)氧的要求不大，靜置條件下達(dá)到最大脫色率的時(shí)間僅比搖床條件下的延長(zhǎng)了2 h，幾乎未受到影響，這一特性使其可適用于工業(yè)染料廢水處理中的各種復(fù)雜體系，并且不會(huì)影響染料廢水的脫色處理。

2.7 初始染料濃度對(duì)膠紅酵母脫色的影響

考察不同初始染料濃度對(duì)膠紅酵母脫色的影響，結(jié)果見(jiàn)圖8。由圖8可知:在14 h內(nèi)膠紅酵母對(duì)結(jié)晶紫的脫色率均達(dá)到90%以上。其中，對(duì)于25 mg/L的結(jié)晶紫，在2 h內(nèi)的脫色率就達(dá)94.46%，這和Candida krusei相似;對(duì)于200 mg/L的染料，二者都是在20 h左右達(dá)到最大脫色率［21］。由于染料對(duì)菌體具有一定的毒性，因此微生物對(duì)200 mg/L結(jié)晶紫的去除率通常低于40%［10，23］。膠紅酵母對(duì)不同濃度結(jié)晶紫的適應(yīng)性較強(qiáng)，在不同濃度條件下，結(jié)晶紫的脫色率都超過(guò)90%，而且耗時(shí)較短。工業(yè)染料廢水中染料濃度較高，因此膠紅酵母所具有的可降解不同濃度結(jié)晶紫的能力，使其適用于工業(yè)化處理染料廢水。

圖8 初始染料濃度對(duì)結(jié)晶紫脫色的影響Fig.8 Effects of initial dye concentration on decolorization of crystal violet

3 結(jié)論

通過(guò)分離篩選獲得1株具有降解結(jié)晶紫能力的膠紅酵母，通過(guò)全波長(zhǎng)掃描證實(shí)其降解能力，后續(xù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)膠紅酵母對(duì)溫度和pH均有較好的適應(yīng)性，對(duì)不同濃度結(jié)晶紫都可達(dá)到較高的脫色率。

在本文的研究基礎(chǔ)之上，下一步將圍繞膠紅酵母降解結(jié)晶紫的詳細(xì)過(guò)程進(jìn)行研究:①降解過(guò)程中涉及的脫色酶及其作用方式;②染料降解過(guò)程中產(chǎn)生的小分子物質(zhì)，以及可能的降解代謝途徑;③染料降解前后的毒性變化，以期在生物降解化工廢水方面提供更好的支持。

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