番茄葉中總黃酮提取工藝及含量測定的研究

杜成智

摘要：為了優(yōu)化番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）葉總黃酮含量的最佳提取工藝并測定其總黃酮的含量。以總黃酮含量為考察指標(biāo)，采用正交設(shè)計的方法研究提取番茄葉總黃酮的工藝條件，并測定其總黃酮含量。結(jié)果表明，影響番茄葉總黃酮提取的主次因素依次為甲醇濃度、溶劑量、超聲時間、浸泡時間；建立了番茄葉總黃酮含量的測定方法。其總黃酮的最佳提取工藝為100%甲醇20 mL，浸泡30 min，超聲30 min；總黃酮的含量測定方法簡便可靠。

關(guān)鍵詞：番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）葉；總黃酮；含量測定；紫外-可見分光光度法；正交設(shè)計

中圖分類號：O623.54 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）02-0392-03

Extraction and Content Determination of Total Flavonoids from Leaves of

Lycopersicon esculentum Mill.

DU Cheng-zhi1，WANG Hui1，F(xiàn)ENG Xu1，LI Yin1，MEN Yan-fei2

（1.Faculty of Pharmacy，Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning 530001，China；

2.No. 303 Hospital of People's Liberation Army， Nanning 530021，China）

Abstract： The extraction technology for total flavonoids were optimized with the content of total flavonoids as test index by orthogonal design. A novel method for determining total flavonoids was developed. The results showed that the factors affecting the total flavonoids extraction were in the order of methanol concentration， solvent amounts， ultrasonic time and soak time. The best extraction technology was as follows： 20 mL 100% methanol， soak time 30 min， ultrasonic time 30 min. The method of determing total flavonoids content was proved to be feasible， effective and simple.

Key words： leaves of Lycopersicon esculentum Mill.； total flavonoids； content determination； UV-vis spectrophotometry； orthogonal design

番茄葉是茄科（Solanceae）茄屬（Solanum L.）的多年生草本植物番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）的葉子，其食用部位為多汁的漿果番茄，又稱西紅柿。番茄葉散發(fā)著特殊氣味，這些氣味來自一些特殊的天然產(chǎn)物，早在20世紀(jì)70～80年代，國外就開始研究其氣味的組成[1，2]。從番茄葉中分離出的揮發(fā)性成分多為含氮化合物和酯類化合物，具有特殊氣味，有較強的水溶性[3]。此外，還發(fā)現(xiàn)番茄葉中含有多種抑菌活性成分，這些活性物質(zhì)既有強極性的，又有非極性和弱極性的，可用于多種溶劑的提取[4，5]。

番茄是廣西壯族自治區(qū)一種重要的農(nóng)業(yè)栽培作物，各地均普遍栽培，每年產(chǎn)生大量且不被利用的番茄葉。本研究擬從番茄葉中提取可作為天然抗氧化劑的物質(zhì)，不僅可提高資源的利用率，而且可帶動番茄產(chǎn)業(yè)鏈，將產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟效益和深遠的社會意義。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

Agilent 8453型紫外可見分光光度計（美國安捷倫科技有限公司）；CP224S型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；SB25-12D型超聲波清洗儀（寧波新芝生物科技股份有限公司，功率600 W，頻率50 Hz）。

番茄葉（批號：20090312、20090416、20090411）來源于廣西百色國家農(nóng)業(yè)科技園區(qū)優(yōu)質(zhì)無公害蔬菜產(chǎn)業(yè)化示范園；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢驗所提供，批號為080-9303）；其余試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精確稱取干燥蘆丁對照品15.20 mg，置于25 mL容量瓶中，100%甲醇溶解，定容，得標(biāo)準(zhǔn)儲備液（含無水蘆丁0.608 0 mg/mL）。精確移取蘆丁對照液2.0 mL置于25 mL容量瓶中，加蒸餾水至6 mL，加入5%亞硝酸鈉溶液1.00 mL，搖勻，靜置6 min；再加10%硝酸鋁溶液1.00 mL，搖勻，靜置6 min；再加4%氫氧化鈉溶液10.00 mL，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，靜置15 min，以空白調(diào)零，從400～800 nm進行全波長掃描，測得510 nm處有最大吸收，因此以510 nm為測定波長，結(jié)果見圖1。

準(zhǔn)確量取蘆丁儲備液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL于25 mL容量瓶中，測定溶液吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，溶液濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出總黃酮濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出總黃酮濃度-吸光度回歸方程：A=11.289C-0.095 11，相關(guān)系數(shù)r=0.999 7。由標(biāo)準(zhǔn)曲線可知在0.024 03～0.072 96 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.2.2 番茄葉中總黃酮的提取工藝研究

甲醇超聲提取法：稱取番茄葉粗粉0.5 g，加甲醇25 mL，超聲60 min，過濾，備用。

甲醇水浴回流提取法：稱取番茄葉粗粉0.5 g，加甲醇25 mL，回流60 min， 過濾，備用。

乙醇超聲提取法：稱取番茄葉粗粉0.5 g，加乙醇25 mL，超聲60 min，過濾，備用。

1.2.3 單因素試驗與正交試驗設(shè)計 根據(jù)單因素試驗結(jié)果進行正交試驗。選用甲醇濃度、溶劑量、超聲時間及浸泡時間4個因素，每個因素選擇3個水平，用L9（34）進行正交試驗設(shè)計優(yōu)選。因素與水平見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄葉中總黃酮的提取工藝研究結(jié)果

精確吸取樣品液2.0 mL，置于25 mL容量瓶中，按“1.2.1”操作，于510 nm測溶液吸光度，計算樣品總黃酮含量，結(jié)果見表2。由表2可知，最佳提取法為甲醇超聲提取法。

2.2 正交試驗結(jié)果

采用正交試驗設(shè)計，選用甲醇濃度、溶劑量、超聲時間及浸泡時間4個因素，每個因素選擇3個水平，用L9（34）正交表進行試驗設(shè)計優(yōu)選，結(jié)果見表3。由表3可知，正交試驗的最優(yōu)水平為A3B2C1D3，即用100%甲醇20 mL浸泡30 min后超聲30 min提取，測得的總黃酮含量最高，確定其為提取番茄葉總黃酮的最佳工藝。影響番茄葉總黃酮提取的主次因素依次為甲醇濃度、溶劑量、超聲時間、浸泡時間。

2.3 驗證試驗

取批號為20090312的番茄葉，以正交試驗的最優(yōu)水平為A3B2C1D3，即用100%甲醇20 mL浸泡30 min后超聲30 min提取，測定其總黃酮含量進行驗證對比試驗。由表4可知，在上述工藝條件下，提取的總黃酮含量較高，達到了優(yōu)化工藝的目的。

2.4 總黃酮含量的測定

2.4.1 精密度試驗 精確稱取番茄葉甲醇提取物樣品1份，按“1.2.1”項下操作，于510 nm測其吸光度值，計算RSD為0.085%（n=6），說明精密度較高。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗 將同一份番茄葉甲醇提取物樣品液，按“1.2.1”項下分別于0、10、20、30、40、50、60 min測定其吸光度值，計算RSD為0.74%，表明供試液中黃酮在測定的60 min內(nèi)可保持穩(wěn)定。

2.4.3 重復(fù)性試驗 將同一待測番茄葉提取液按“1.2.1”進行操作，平行測定6次，結(jié)果RSD為1.5%。

2.4.4 回收率的測定 準(zhǔn)確稱取3份番茄葉甲醇提取物樣品，每份0.20 g。分別加入一定量的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，按“1.2.1”項下操作，在510 nm測吸光度，得出總黃酮含量?；厥章式Y(jié)果見表5。

2.4.5 不同批號番茄葉總黃酮含量測定 準(zhǔn)確稱取三批樣品6份各0.4 g，按“1.2.1”項下操作，測定溶液吸光度，將吸光度代入回歸方程計算得到總黃酮的濃度，并計算得其含量。番茄葉提取物中總黃酮的含量見表6。

3 小結(jié)與討論

1）番茄葉中可能含有黃酮。黃酮具有廣泛的生物活性，為了進一步研究番茄葉的總黃酮含量，本研究首次用正交試驗設(shè)計，對番茄葉中總黃酮的提取工藝進行了研究。在試驗中，先考察了提取的影響因素，除了提取方法外，超聲時間、甲醇濃度、浸泡時間和溶劑量對提取效率均有影響，故以這些參數(shù)設(shè)計了正交試驗，確定了影響番茄葉總黃酮提取的主次因素依次為：甲醇濃度>溶劑量>超聲時間>浸泡時間，最佳提取方案為100%甲醇20 mL浸泡30 min后超聲30 min提取。

2）本研究采用紫外-可見分光光度法測定了番茄葉中總黃酮的含量，精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性良好，加樣回收率合格，為番茄葉中總黃酮的含量測定提供了一種簡便可行的方法，為番茄葉的質(zhì)量控制提供了評價手段。

參考文獻：

[1] DIRINCK P，SCHREYEN L，SCHAM P N.Flavor qualily of apples and tomatoes[J]. Appl Spectrom Mass（SM），1975，15（4）：427-435.

[2] LUNDGREN L，NORELIUS C，STENHAGEN G. Leaf volatiles from some wild tomato species[J]. Nord J Bot，1985，5（4）：315-320.

[3] 李水清，于信洋. 番茄莖葉提取物對菜粉蝶的生物活性研究[J]. 長江大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2007，4（2）：1-4.

[4] 楊從軍，孟昭禮，郭 景，等.番茄莖葉提取物對8種植物病原菌的生物活性初步研究[J].植物保護，2005，31（1）：28-31.

[5] 銀永忠，何青云，陳莉華，等. 廢棄番茄葉中葉綠素超聲-微波協(xié)同的提取工藝[J]. 光譜實驗室，2011，28（5）：2578-2583.

1.2.2 番茄葉中總黃酮的提取工藝研究

甲醇超聲提取法：稱取番茄葉粗粉0.5 g，加甲醇25 mL，超聲60 min，過濾，備用。

甲醇水浴回流提取法：稱取番茄葉粗粉0.5 g，加甲醇25 mL，回流60 min， 過濾，備用。

乙醇超聲提取法：稱取番茄葉粗粉0.5 g，加乙醇25 mL，超聲60 min，過濾，備用。

1.2.3 單因素試驗與正交試驗設(shè)計 根據(jù)單因素試驗結(jié)果進行正交試驗。選用甲醇濃度、溶劑量、超聲時間及浸泡時間4個因素，每個因素選擇3個水平，用L9（34）進行正交試驗設(shè)計優(yōu)選。因素與水平見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄葉中總黃酮的提取工藝研究結(jié)果

精確吸取樣品液2.0 mL，置于25 mL容量瓶中，按“1.2.1”操作，于510 nm測溶液吸光度，計算樣品總黃酮含量，結(jié)果見表2。由表2可知，最佳提取法為甲醇超聲提取法。

2.2 正交試驗結(jié)果

采用正交試驗設(shè)計，選用甲醇濃度、溶劑量、超聲時間及浸泡時間4個因素，每個因素選擇3個水平，用L9（34）正交表進行試驗設(shè)計優(yōu)選，結(jié)果見表3。由表3可知，正交試驗的最優(yōu)水平為A3B2C1D3，即用100%甲醇20 mL浸泡30 min后超聲30 min提取，測得的總黃酮含量最高，確定其為提取番茄葉總黃酮的最佳工藝。影響番茄葉總黃酮提取的主次因素依次為甲醇濃度、溶劑量、超聲時間、浸泡時間。

2.3 驗證試驗

取批號為20090312的番茄葉，以正交試驗的最優(yōu)水平為A3B2C1D3，即用100%甲醇20 mL浸泡30 min后超聲30 min提取，測定其總黃酮含量進行驗證對比試驗。由表4可知，在上述工藝條件下，提取的總黃酮含量較高，達到了優(yōu)化工藝的目的。

2.4 總黃酮含量的測定

2.4.1 精密度試驗 精確稱取番茄葉甲醇提取物樣品1份，按“1.2.1”項下操作，于510 nm測其吸光度值，計算RSD為0.085%（n=6），說明精密度較高。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗 將同一份番茄葉甲醇提取物樣品液，按“1.2.1”項下分別于0、10、20、30、40、50、60 min測定其吸光度值，計算RSD為0.74%，表明供試液中黃酮在測定的60 min內(nèi)可保持穩(wěn)定。

2.4.3 重復(fù)性試驗 將同一待測番茄葉提取液按“1.2.1”進行操作，平行測定6次，結(jié)果RSD為1.5%。

2.4.4 回收率的測定 準(zhǔn)確稱取3份番茄葉甲醇提取物樣品，每份0.20 g。分別加入一定量的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，按“1.2.1”項下操作，在510 nm測吸光度，得出總黃酮含量。回收率結(jié)果見表5。

2.4.5 不同批號番茄葉總黃酮含量測定 準(zhǔn)確稱取三批樣品6份各0.4 g，按“1.2.1”項下操作，測定溶液吸光度，將吸光度代入回歸方程計算得到總黃酮的濃度，并計算得其含量。番茄葉提取物中總黃酮的含量見表6。

3 小結(jié)與討論

1）番茄葉中可能含有黃酮。黃酮具有廣泛的生物活性，為了進一步研究番茄葉的總黃酮含量，本研究首次用正交試驗設(shè)計，對番茄葉中總黃酮的提取工藝進行了研究。在試驗中，先考察了提取的影響因素，除了提取方法外，超聲時間、甲醇濃度、浸泡時間和溶劑量對提取效率均有影響，故以這些參數(shù)設(shè)計了正交試驗，確定了影響番茄葉總黃酮提取的主次因素依次為：甲醇濃度>溶劑量>超聲時間>浸泡時間，最佳提取方案為100%甲醇20 mL浸泡30 min后超聲30 min提取。

2）本研究采用紫外-可見分光光度法測定了番茄葉中總黃酮的含量，精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性良好，加樣回收率合格，為番茄葉中總黃酮的含量測定提供了一種簡便可行的方法，為番茄葉的質(zhì)量控制提供了評價手段。

參考文獻：

[1] DIRINCK P，SCHREYEN L，SCHAM P N.Flavor qualily of apples and tomatoes[J]. Appl Spectrom Mass（SM），1975，15（4）：427-435.

[2] LUNDGREN L，NORELIUS C，STENHAGEN G. Leaf volatiles from some wild tomato species[J]. Nord J Bot，1985，5（4）：315-320.

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[5] 銀永忠，何青云，陳莉華，等. 廢棄番茄葉中葉綠素超聲-微波協(xié)同的提取工藝[J]. 光譜實驗室，2011，28（5）：2578-2583.

1.2.2 番茄葉中總黃酮的提取工藝研究

甲醇超聲提取法：稱取番茄葉粗粉0.5 g，加甲醇25 mL，超聲60 min，過濾，備用。

甲醇水浴回流提取法：稱取番茄葉粗粉0.5 g，加甲醇25 mL，回流60 min， 過濾，備用。

乙醇超聲提取法：稱取番茄葉粗粉0.5 g，加乙醇25 mL，超聲60 min，過濾，備用。

1.2.3 單因素試驗與正交試驗設(shè)計 根據(jù)單因素試驗結(jié)果進行正交試驗。選用甲醇濃度、溶劑量、超聲時間及浸泡時間4個因素，每個因素選擇3個水平，用L9（34）進行正交試驗設(shè)計優(yōu)選。因素與水平見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄葉中總黃酮的提取工藝研究結(jié)果

精確吸取樣品液2.0 mL，置于25 mL容量瓶中，按“1.2.1”操作，于510 nm測溶液吸光度，計算樣品總黃酮含量，結(jié)果見表2。由表2可知，最佳提取法為甲醇超聲提取法。

2.2 正交試驗結(jié)果

采用正交試驗設(shè)計，選用甲醇濃度、溶劑量、超聲時間及浸泡時間4個因素，每個因素選擇3個水平，用L9（34）正交表進行試驗設(shè)計優(yōu)選，結(jié)果見表3。由表3可知，正交試驗的最優(yōu)水平為A3B2C1D3，即用100%甲醇20 mL浸泡30 min后超聲30 min提取，測得的總黃酮含量最高，確定其為提取番茄葉總黃酮的最佳工藝。影響番茄葉總黃酮提取的主次因素依次為甲醇濃度、溶劑量、超聲時間、浸泡時間。

2.3 驗證試驗

取批號為20090312的番茄葉，以正交試驗的最優(yōu)水平為A3B2C1D3，即用100%甲醇20 mL浸泡30 min后超聲30 min提取，測定其總黃酮含量進行驗證對比試驗。由表4可知，在上述工藝條件下，提取的總黃酮含量較高，達到了優(yōu)化工藝的目的。

2.4 總黃酮含量的測定

2.4.1 精密度試驗 精確稱取番茄葉甲醇提取物樣品1份，按“1.2.1”項下操作，于510 nm測其吸光度值，計算RSD為0.085%（n=6），說明精密度較高。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗 將同一份番茄葉甲醇提取物樣品液，按“1.2.1”項下分別于0、10、20、30、40、50、60 min測定其吸光度值，計算RSD為0.74%，表明供試液中黃酮在測定的60 min內(nèi)可保持穩(wěn)定。

2.4.3 重復(fù)性試驗 將同一待測番茄葉提取液按“1.2.1”進行操作，平行測定6次，結(jié)果RSD為1.5%。

2.4.4 回收率的測定 準(zhǔn)確稱取3份番茄葉甲醇提取物樣品，每份0.20 g。分別加入一定量的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，按“1.2.1”項下操作，在510 nm測吸光度，得出總黃酮含量?；厥章式Y(jié)果見表5。

2.4.5 不同批號番茄葉總黃酮含量測定 準(zhǔn)確稱取三批樣品6份各0.4 g，按“1.2.1”項下操作，測定溶液吸光度，將吸光度代入回歸方程計算得到總黃酮的濃度，并計算得其含量。番茄葉提取物中總黃酮的含量見表6。

3 小結(jié)與討論

1）番茄葉中可能含有黃酮。黃酮具有廣泛的生物活性，為了進一步研究番茄葉的總黃酮含量，本研究首次用正交試驗設(shè)計，對番茄葉中總黃酮的提取工藝進行了研究。在試驗中，先考察了提取的影響因素，除了提取方法外，超聲時間、甲醇濃度、浸泡時間和溶劑量對提取效率均有影響，故以這些參數(shù)設(shè)計了正交試驗，確定了影響番茄葉總黃酮提取的主次因素依次為：甲醇濃度>溶劑量>超聲時間>浸泡時間，最佳提取方案為100%甲醇20 mL浸泡30 min后超聲30 min提取。

2）本研究采用紫外-可見分光光度法測定了番茄葉中總黃酮的含量，精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性良好，加樣回收率合格，為番茄葉中總黃酮的含量測定提供了一種簡便可行的方法，為番茄葉的質(zhì)量控制提供了評價手段。

參考文獻：

[1] DIRINCK P，SCHREYEN L，SCHAM P N.Flavor qualily of apples and tomatoes[J]. Appl Spectrom Mass（SM），1975，15（4）：427-435.

[2] LUNDGREN L，NORELIUS C，STENHAGEN G. Leaf volatiles from some wild tomato species[J]. Nord J Bot，1985，5（4）：315-320.

[3] 李水清，于信洋. 番茄莖葉提取物對菜粉蝶的生物活性研究[J]. 長江大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2007，4（2）：1-4.

[4] 楊從軍，孟昭禮，郭 景，等.番茄莖葉提取物對8種植物病原菌的生物活性初步研究[J].植物保護，2005，31（1）：28-31.

[5] 銀永忠，何青云，陳莉華，等. 廢棄番茄葉中葉綠素超聲-微波協(xié)同的提取工藝[J]. 光譜實驗室，2011，28（5）：2578-2583.