小白菜無(wú)性快繁體系的建立

劉思言等

摘要：以四季小白菜（Brassica chinensis L.）和美國(guó)雜交小白菜為材料，建立了小白菜的無(wú)性快繁體系。結(jié)果表明，最佳的滅菌方法為用70%的乙醇處理30 s，

關(guān)鍵詞：小白菜（Brassica chinensis L.）；滅菌方法；無(wú)性快繁體系

中圖分類(lèi)號(hào)：S634.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）02-0444-03

Establishment of the Asexual Rapid Propagation System of Pakchoi

LIU Si-yan1a，QU Bo1a，GAO Wei2，XIA Hai-feng2，GUAN Shu-yan1a，YAO Dan1a，WANG Pi-wu1b

（1a.College of Life Sciences；1b. College of Agronomy，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China；

2.Tonghua Academy of Agricultural Sciences，Meihekou 135007，Jilin，China）

Abstract： Using the pakchoi of four seasons and hybrid pakchoi from the United States as materials， an asexual rapid propagation system of pakchoi was established. The results showed that the best seed sterilization method was 70% alcohol for 30 s， then sodium hypochlorite sterilization for 15 min. MS + 0.25 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L NAA was the best for callus induction. MS + 3.0 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L NAA was the best for budding induction. MS + 0.2 mg/L NAA was the best for root induction.

Key words： pakchoi（Brassica chinensis L.）； sterilization method； asexual rapid propagation system

小白菜（Brassica chinensis L.），又稱(chēng)青菜，屬十字花科蕓苔屬，葉不結(jié)球卵狀匙形，葉柄有狹邊。小白菜原產(chǎn)于我國(guó)，品種很多，由于其抗寒性很強(qiáng)，易貯藏和運(yùn)輸，是我國(guó)多數(shù)地區(qū)常見(jiàn)蔬菜之一[1]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人們開(kāi)始利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)現(xiàn)有的蔬菜品種進(jìn)行改良[2，3]，小白菜無(wú)性快繁方面的研究已經(jīng)有了許多報(bào)道[4-12]。本試驗(yàn)以四季小白菜和美國(guó)雜交小白菜種子誘導(dǎo)出的無(wú)菌實(shí)生苗為材料，以MS為基本培養(yǎng)基，以6-BA及NAA為調(diào)節(jié)激素，優(yōu)化最佳的種子滅菌時(shí)間、誘導(dǎo)愈傷組織的最佳激素濃度、誘導(dǎo)不定芽分化和生根的最佳激素濃度，為小白菜的轉(zhuǎn)基因研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)采用四季小白菜和美國(guó)雜交小白菜的無(wú)菌實(shí)生苗為材料。

1.2 方法

1.2.1 無(wú)菌實(shí)生苗的獲得 選取飽滿、大小一致兩種小白菜種子用清水浸泡備用。種子滅菌采用3種方法：①用70%的乙醇處理30 s，再用0.1%的升汞消毒10 min，無(wú)菌水沖洗3次。②用70%的乙醇處理30 s，再用3%的次氯酸鈉消毒10 min，無(wú)菌水沖洗3次。③用70%的乙醇處理30 s，再用3%的次氯酸鈉消毒15 min，無(wú)菌水沖洗3次。將以上滅菌消毒后的種子接種到MS培養(yǎng)基上，12 d后統(tǒng)計(jì)其出苗率、污染率。

1.2.2 愈傷組織的誘導(dǎo) 以無(wú)菌實(shí)生苗的葉片作為外植體材料，以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的NAA（0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mg/L）和6-BA（0.25 mg/L），進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)，20 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率。

1.2.3 不定芽分化的誘導(dǎo) 以含芽原基的莖段為材料，以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的NAA（0.3、0.5、0.8 mg/L）和6-BA（3.0 mg/L）進(jìn)行不定芽分化的誘導(dǎo)，15 d后統(tǒng)計(jì)不定芽分化率。

1.2.4 不定芽生根的誘導(dǎo) 將生長(zhǎng)健壯的小白菜的無(wú)根苗，以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的NAA（0.1、0.2、0.3 mg/L），進(jìn)行小白菜的不定芽生根的誘導(dǎo)，20 d統(tǒng)計(jì)不定芽生根率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同滅菌方法對(duì)種子萌發(fā)的影響

將用3種不同方法滅菌的小白菜種子接種到MS培養(yǎng)基上，置于培養(yǎng)室中光照培養(yǎng)，12 d后統(tǒng)計(jì)其出苗率、污染率，結(jié)果見(jiàn)表1。從表1可以看出，對(duì)于四季小白菜而言，用0.1%的升汞消毒10 min的方法①和用3%的次氯酸鈉消毒10 min的方法②的污染率分別為12.0%和39.3%，出苗率分別為68.7%和56.7%，用次氯酸鈉滅菌15 min的方法③的效果最好，污染率為10.7%，出苗率為80.7%；對(duì)于美國(guó)雜交小白菜而言，方法①和方法②的污染率分別為16.0%和32.0%，出苗率分別為63.3%和64.7%，方法③的污染率為12.0%，出苗率為90.0%。綜上所述，對(duì)于兩種小白菜而言，用次氯酸鈉滅菌15 min的方法③都是較為理想的小白菜種子滅菌方法。

2.2 不同激素濃度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

以無(wú)菌實(shí)生苗的葉片作為外植體材料，以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的NAA（0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mg/L）和6-BA（0.25 mg/L），進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)，20 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率，結(jié)果見(jiàn)表2。從表2可以看出，四季小白菜采用MS+0.5 mg/L NAA+0.25 mg/L 6-BA的愈傷組織誘導(dǎo)率高達(dá)48.0%，美國(guó)雜交小白菜采用MS+0.5 mg/L NAA+0.25 mg/L 6-BA的愈傷組織誘導(dǎo)率高達(dá)44.0%。

2.3 不同激素濃度對(duì)不定芽分化誘導(dǎo)的影響

以含芽原基的莖段為材料，以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的NAA（0.3、0.5、0.8 mg/L）和6-BA（3.0 mg/L）進(jìn)行不定芽分化的誘導(dǎo)，15 d后統(tǒng)計(jì)不定芽分化率，結(jié)果見(jiàn)表3。從表3可以看出，對(duì)于四季小白菜和美國(guó)雜交小白菜采用MS+3.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA誘導(dǎo)出芽的效果均最好，分別達(dá)92.0%和80.0%。

2.4 不同激素濃度對(duì)不定芽生根誘導(dǎo)的影響

將生長(zhǎng)健壯的小白菜的無(wú)根苗，以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的NAA（0.1、0.2、0.3 mg/L），進(jìn)行小白菜的不定芽生根的誘導(dǎo)，20 d統(tǒng)計(jì)不定芽生根率，結(jié)果見(jiàn)表4。從表4可以看出，四季小白菜和美國(guó)雜交小白菜的無(wú)根苗誘導(dǎo)生根的最佳NAA濃度為0.2 mg/L，且根的生長(zhǎng)狀況最好。

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)比較了兩種滅菌試劑（升汞和次氯酸鈉）對(duì)種子滅菌的效果。一般而言，升汞的滅菌效果好，但其殘留液最難除去，對(duì)植物組織的傷害很大[13]，所以在本試驗(yàn)中用升汞滅菌10 min后，雖然污染率很低，但發(fā)芽率也很低，而利用次氯酸鈉滅菌15 min后，兩種小白菜的發(fā)芽率分別能達(dá)到80.7%和90.0%，這和趙慧等[14]的研究結(jié)果基本一致。

本試驗(yàn)以四季小白菜種子和美國(guó)雜交小白菜種子為試驗(yàn)材料，建立了小白菜的離體再生體系，MS+ 0.25 mg/L 6-BA +0.5 mg/L NAA為最佳的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基；MS+3.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA為最佳的不定芽分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基；MS+0.2 mg/L NAA為最佳的生根培養(yǎng)基。

參考文獻(xiàn)：

[1] 張嵐翠，崔 帥，崔 博，等.小白菜無(wú)性系的建立[J].大連教育學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，20（4）：71-73.

[2] 范正琪，崔海瑞，王忠華，等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的白菜遺傳轉(zhuǎn)化影響因子研究進(jìn)展[J].金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，21（3）：10-13.

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[5] 陳敏敏，侯喜林.不結(jié)球白菜離體培養(yǎng)再生體系的優(yōu)化[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，31（1）：27-30.

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[7] 侯喜林，曹壽椿.不結(jié)球白菜子葉離體培養(yǎng)再生植株[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1994，17（3）：60-64.

[8] 秦新民，高成偉.小白菜子葉離體培養(yǎng)再生系統(tǒng)的建立[J].廣西師范大學(xué)學(xué)報(bào)，1997，15（4）：90-91.

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[10] 張 鵬，凌定厚.提高菜心離體植株再生頻率的研究[J].植物學(xué)報(bào)，1995，37（11）：902-908.

[11] 蔡小寧，佘建民.不結(jié)球下胚軸和子葉離體培養(yǎng)再生植株[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，1995，11（4）：51-54.

[12] 張智奇，周 音.小白菜子葉誘導(dǎo)不定芽再生植株[J].上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，1998，14（2）：25-28.

[13] 柳 俊，謝從華.植物細(xì)胞工程[M].北京：高等教育出版社，2011.

[14] 趙 慧，侯雷平，王 慧，等.影響小白菜子葉再生的因素[J].分子植物育種，2009，7（5）：972-977.

2.2 不同激素濃度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

以無(wú)菌實(shí)生苗的葉片作為外植體材料，以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的NAA（0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mg/L）和6-BA（0.25 mg/L），進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)，20 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率，結(jié)果見(jiàn)表2。從表2可以看出，四季小白菜采用MS+0.5 mg/L NAA+0.25 mg/L 6-BA的愈傷組織誘導(dǎo)率高達(dá)48.0%，美國(guó)雜交小白菜采用MS+0.5 mg/L NAA+0.25 mg/L 6-BA的愈傷組織誘導(dǎo)率高達(dá)44.0%。

2.3 不同激素濃度對(duì)不定芽分化誘導(dǎo)的影響

以含芽原基的莖段為材料，以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的NAA（0.3、0.5、0.8 mg/L）和6-BA（3.0 mg/L）進(jìn)行不定芽分化的誘導(dǎo)，15 d后統(tǒng)計(jì)不定芽分化率，結(jié)果見(jiàn)表3。從表3可以看出，對(duì)于四季小白菜和美國(guó)雜交小白菜采用MS+3.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA誘導(dǎo)出芽的效果均最好，分別達(dá)92.0%和80.0%。

2.4 不同激素濃度對(duì)不定芽生根誘導(dǎo)的影響

將生長(zhǎng)健壯的小白菜的無(wú)根苗，以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的NAA（0.1、0.2、0.3 mg/L），進(jìn)行小白菜的不定芽生根的誘導(dǎo)，20 d統(tǒng)計(jì)不定芽生根率，結(jié)果見(jiàn)表4。從表4可以看出，四季小白菜和美國(guó)雜交小白菜的無(wú)根苗誘導(dǎo)生根的最佳NAA濃度為0.2 mg/L，且根的生長(zhǎng)狀況最好。

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)比較了兩種滅菌試劑（升汞和次氯酸鈉）對(duì)種子滅菌的效果。一般而言，升汞的滅菌效果好，但其殘留液最難除去，對(duì)植物組織的傷害很大[13]，所以在本試驗(yàn)中用升汞滅菌10 min后，雖然污染率很低，但發(fā)芽率也很低，而利用次氯酸鈉滅菌15 min后，兩種小白菜的發(fā)芽率分別能達(dá)到80.7%和90.0%，這和趙慧等[14]的研究結(jié)果基本一致。

本試驗(yàn)以四季小白菜種子和美國(guó)雜交小白菜種子為試驗(yàn)材料，建立了小白菜的離體再生體系，MS+ 0.25 mg/L 6-BA +0.5 mg/L NAA為最佳的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基；MS+3.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA為最佳的不定芽分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基；MS+0.2 mg/L NAA為最佳的生根培養(yǎng)基。

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[12] 張智奇，周 音.小白菜子葉誘導(dǎo)不定芽再生植株[J].上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，1998，14（2）：25-28.

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2.2 不同激素濃度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

以無(wú)菌實(shí)生苗的葉片作為外植體材料，以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的NAA（0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mg/L）和6-BA（0.25 mg/L），進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)，20 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率，結(jié)果見(jiàn)表2。從表2可以看出，四季小白菜采用MS+0.5 mg/L NAA+0.25 mg/L 6-BA的愈傷組織誘導(dǎo)率高達(dá)48.0%，美國(guó)雜交小白菜采用MS+0.5 mg/L NAA+0.25 mg/L 6-BA的愈傷組織誘導(dǎo)率高達(dá)44.0%。

2.3 不同激素濃度對(duì)不定芽分化誘導(dǎo)的影響

以含芽原基的莖段為材料，以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的NAA（0.3、0.5、0.8 mg/L）和6-BA（3.0 mg/L）進(jìn)行不定芽分化的誘導(dǎo)，15 d后統(tǒng)計(jì)不定芽分化率，結(jié)果見(jiàn)表3。從表3可以看出，對(duì)于四季小白菜和美國(guó)雜交小白菜采用MS+3.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA誘導(dǎo)出芽的效果均最好，分別達(dá)92.0%和80.0%。

2.4 不同激素濃度對(duì)不定芽生根誘導(dǎo)的影響

將生長(zhǎng)健壯的小白菜的無(wú)根苗，以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的NAA（0.1、0.2、0.3 mg/L），進(jìn)行小白菜的不定芽生根的誘導(dǎo)，20 d統(tǒng)計(jì)不定芽生根率，結(jié)果見(jiàn)表4。從表4可以看出，四季小白菜和美國(guó)雜交小白菜的無(wú)根苗誘導(dǎo)生根的最佳NAA濃度為0.2 mg/L，且根的生長(zhǎng)狀況最好。

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)比較了兩種滅菌試劑（升汞和次氯酸鈉）對(duì)種子滅菌的效果。一般而言，升汞的滅菌效果好，但其殘留液最難除去，對(duì)植物組織的傷害很大[13]，所以在本試驗(yàn)中用升汞滅菌10 min后，雖然污染率很低，但發(fā)芽率也很低，而利用次氯酸鈉滅菌15 min后，兩種小白菜的發(fā)芽率分別能達(dá)到80.7%和90.0%，這和趙慧等[14]的研究結(jié)果基本一致。

本試驗(yàn)以四季小白菜種子和美國(guó)雜交小白菜種子為試驗(yàn)材料，建立了小白菜的離體再生體系，MS+ 0.25 mg/L 6-BA +0.5 mg/L NAA為最佳的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基；MS+3.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA為最佳的不定芽分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基；MS+0.2 mg/L NAA為最佳的生根培養(yǎng)基。

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