超聲、微波聯(lián)合預(yù)處理大米蛋白制備ACE抑制肽工藝優(yōu)化

王 申 周 佳 徐 晶 尹帥星 吳永寧 宮智勇

WANG Shen 1 ZHOU Jia 1 XU Jing 1 YIN Shuai－xing 1 WU Yong－nin 2 GONG Zhi－yong 1

（1.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；2.國家食品安全風(fēng)險評估中心，北京 100021）

（1.College of Food Science and Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan，Hubei 430023，China；2.China National Center for Food Safety Risk Assessment，Beijing 100021，China）

目前市場上銷售的大米蛋白主要是大米淀粉生產(chǎn)的副產(chǎn)物，也可從米糠和碎米中直接提取。在谷物蛋白質(zhì)中，大米蛋白的價值主要體現(xiàn)在它的低過敏性、無色素干擾、柔和的味道及高營養(yǎng)價值上［1，2］。近年來，從動植物蛋白質(zhì)中獲取生物活性肽成為食品科學(xué)研究領(lǐng)域的一個熱點。來源于食物蛋白的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）抑制肽對高血壓患者有降壓作用［3］，但血壓正常者服用則無降壓作用，安全性高且無副作用，特別適于作為口服藥劑或功能性食品中的有效成分［4，5］。目前，乳清蛋白、酪蛋白、大豆蛋白、牛血漿、玉米胚芽中都分離出了ACE抑制肽［6］。

已有很多研究［7－9］表明，大米多肽具有良好的ACE抑制活性。現(xiàn)在制備大米生物活性肽的常用方法是酶法［9，10］，但這種方法存在酶解效率低，產(chǎn)物活性不高的問題［11］。胡子豪等［12］探討如何提高食源性ACE抑制肽活性的方法中，提到可在提取過程中改進試驗路線以達到目的。超聲波預(yù)處理可促使蛋白質(zhì)親水基團更多地暴露出來，提高其在水中的溶解度，有利于酶和蛋白質(zhì)底物結(jié)合，最終提高酶解效率［13］。同時有研究［14］表明，微波可輔助蛋白質(zhì)及其衍生物一級結(jié)構(gòu)進行水解，微波加熱可在短時間內(nèi)達到很高的溫度，減少對蛋白質(zhì)本身的傷害，并且微波能通過改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象影響它的生物活性。超聲—微波處理已被應(yīng)用于提高米飯品質(zhì)［15］和優(yōu)化豆粕中總黃酮提?。?6］等的研究中。而大米蛋白預(yù)處理研究中，賈俊強等［17］采用超聲波預(yù)處理大米蛋白制備抗氧化肽，馬海樂等［11］采用超聲波處理大米蛋白制備大米降血壓多肽，還未有采用超聲、微波聯(lián)合預(yù)處理大米蛋白的研究。本研究采用超聲處理、微波加熱的方法對大米蛋白進行聯(lián)合預(yù)處理，以提高酶解大米蛋白制備ACE抑制肽的效率，為大米資源的進一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大米蛋白：蛋白質(zhì)含量81.37%，江西恒天實業(yè)有限公司；

堿性蛋白酶：2.4 U／g，丹麥 Novo Nordisk公司；

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）、馬尿酰—組氨?！涟彼幔℉HL）、馬尿酸（Hip）：美國Sigma公司；

乙腈、三氟乙酸：色譜純，中國醫(yī)藥集團總公司；

鹽酸、氫氧化鈉：分析純，中國醫(yī)藥集團總公司；

p H校正緩沖液：梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀：Agilent 1200型，美國Agilent公司；

酸度計：320－S型，梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司；

電子天平：FA2104型，上海民僑精密儀器有限公司；

冷凍干燥機：LG－3型，寧波市生化儀器廠；

集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：DF－101S型，予華儀器有限責(zé)任公司；

離心機：TGL－205型，長沙平凡儀器儀表有限公司；

微波、紫外、超聲波三位一體合成萃取反應(yīng)儀：UWave－1000型，上海新儀微波化學(xué)科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程

粉碎大米蛋白→加雙蒸水混勻→超聲、微波預(yù)處理→酶解→離心（4 000 r／min，10 min）→上清液→調(diào)p H 值至7→真空冷凍干燥→大米多肽粗品→檢測對ACE的抑制率

1.3.2 單因素試驗設(shè)計

分別考察超聲功率、超聲處理時間、微波處理溫度、攪拌速度對大米多肽ACE抑制率的影響。

（1）超聲波功率的影響：在超聲時間35 min、微波加熱溫度45℃、攪拌速度900 r／min下，將樣品分別在超聲波功率150，350，550，750 W 下進行預(yù)處理之后酶解，考察ACE抑制活性。

（2）預(yù)處理時間的影響：在超聲功率150 W、微波加熱溫度45℃、攪拌速度900 r／min下，將樣品分別預(yù)處理15，25，35，45 min之后進行酶解，考察ACE抑制活性。

（3）微波加熱溫度的影響：在超聲功率150 W、作用時間35 min、攪拌速度900 r／min下，將樣品分別在微波加熱溫度35，45，55，65℃下進行預(yù)處理之后酶解，考察 ACE抑制活性。

（4）攪拌速度的影響：在超聲功率150 W、微波加熱溫度45℃、作用時間35 min下，將樣品分別按250，750，1 250，1 750 r／min的攪拌速度進行預(yù)處理之后酶解，考察ACE抑制活性。

1.3.3 超聲、微波預(yù)處理正交試驗設(shè)計 根據(jù)單因素試驗研究結(jié)果，對超聲預(yù)處理條件進行正交優(yōu)化。經(jīng)過超聲微波預(yù)處理后，對大米蛋白進行酶解反應(yīng)。酶解參數(shù)：底物質(zhì)量濃度7.5%（m／V），堿性蛋白酶與底物蛋白質(zhì)量比2%，溫度55℃，p H 9.0，酶 解 時 間 120 min［18］。 以 酶 解 產(chǎn) 物 對ACE的抑制率評價其降血壓活性。

1.3.4 血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性的測定 參照文獻［19］。

1.3.5 半抑制濃度（IC50）的測定 稱取大米肽樣品，配成不同質(zhì)量濃度梯度的大米多肽粗品溶液，分別測定其對ACE的抑制率。以不同稀釋濃度的大米肽ACE抑制率與大米肽濃度做曲線，通過擬合的曲線方程，計算當(dāng)ACE抑制率為50%時，所對應(yīng)大米肽的濃度值，即IC。

2 結(jié)果與討論

2.1 超聲波預(yù)處理單因素試驗

2.1.1 超聲波功率的影響 由圖1可知，超聲波功率在150～550 W范圍內(nèi)隨著功率的升高，酶解產(chǎn)物ACE抑制率逐步提高，在550 W時抑制率達到最高；當(dāng)超聲波功率大于550 W時，酶解產(chǎn)物ACE抑制率開始下降。說明在一定范圍內(nèi)增加超聲波功率可改變蛋白質(zhì)構(gòu)象，促使其親水基團更多地暴露出來，提高蛋白質(zhì)在水中的溶解度，有利于酶和蛋白質(zhì)底物結(jié)合，從而提高酶解產(chǎn)物ACE抑制率［11］，但過高會破壞蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，從而降低酶解產(chǎn)物ACE抑制率，所以提取超聲波功率在400，500，600 W較為適宜。

圖1 超聲波功率對酶解產(chǎn)物ACE抑制率的影響Figure 1 Influence of ultrasonic power on ACE inhibitory activity of hydrolysate

圖2 預(yù)處理時間對酶解產(chǎn)物ACE抑制率的影響Figure 2 Influence of action time on ACE inhibitory activity of hydrolysate

2.1.2 預(yù)處理時間的影響 由圖2可知，隨著作用時間的增加，酶解產(chǎn)物ACE抑制率逐步增加，在25 min時ACE抑制率最高，之后抑制率逐漸降低。這個過程可能是大米蛋白隨著預(yù)處理時間的延長，大米蛋白的溶解度提高，一定時間后蛋白質(zhì)的溶解達到飽和，若再進一步延長預(yù)處理時間，可能破壞蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，造成酶解產(chǎn)物ACE抑制率降低。所以選取20，25，30 min為正交試驗的水平因素。

2.1.3 微波加熱溫度的影響 由圖3可知，隨著微波加熱溫度的提高，ACE抑制率先上升后下降，但ACE抑制率增幅較慢，同時ACE抑制率相差不大，考慮到接下來的酶解試驗的溫度為55℃，選取45，50，55℃的數(shù)據(jù)進行正交試驗。

圖3 微波加熱溫度對酶解產(chǎn)物ACE抑制率的影響Figure 3 Influence of heating temperature on ACE inhibitory activity of hydrolysate

2.1.4 攪拌速度的影響 由圖4可知，隨著攪拌速度的升高，酶解產(chǎn)物 ACE抑制率也逐步升高，在達到700 r／min時，抑制率最高，當(dāng)攪拌速度超過700 r／min時，抑制率下降，可能攪拌速度過高導(dǎo)致機械力化學(xué)效應(yīng)過高引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變［22］，因此最適攪拌速度為700 r／min左右。所以選取500，700，900 r／min作為正交試驗的因素水平。

圖4 攪拌速度對酶解產(chǎn)物ACE抑制率的影響Figure 4 Influence of stirring rate on ACE inhibitory activity of hydrolysate

2.2 正交試驗結(jié)果分析

根據(jù)單因素試驗研究結(jié)果，對超聲預(yù)處理條件進行正交優(yōu)化。選取超聲功率、超聲處理時間、超聲處理溫度（超聲處理時保持恒溫）、攪拌速度做4因素3水平正交分析試驗，4因素3水平編碼表見表1。

表1 正交試驗設(shè)計Table 1 Orthogonal experiment design

由表2可知，影響酶解產(chǎn)物ACE抑制活性主次順序為A＞D＞B＞C。綜合上述試驗結(jié)果與分析，大米蛋白預(yù)處理的最佳工藝條件為A2D1B1C3，即超聲波功率為500 W、攪拌速度為500 r／min、作用時間為20 min、微波加熱溫度為55℃，此時酶解后酶解產(chǎn)物ACE活性最高。在此條件下，進行驗證實驗，測得ACE抑制率為90.70%。

表2 L9（34）正交試驗結(jié)果Table 2 L9（34）Orthogonal experiment result

2.3 最優(yōu)條件下大米多肽的IC50

圖5 不同質(zhì)量濃度大米肽對ACE抑制活性Figure 5 ACE inhibitory activity of rice peptide at different concentrations

由圖5可知，隨著大米肽質(zhì)量濃度的升高，其對ACE的抑制率也逐步升高。當(dāng)大米肽質(zhì)量濃度為1.6 mg／m L時，ACE的抑制率最高，為85.87%。通過計算可得大米肽對ACE抑制的IC50為0.226 mg／m L。結(jié)果表明，本次研究得到的大米肽具有很強的ACE抑制活性，比馬海樂等［11］研究得到的大米降血壓肽（IC50＝1.71 mg／m L）和從玉米濕磨副產(chǎn)品中分離出的 ACE抑制肽［5］（IC50＝1.02 mg／m L）要高。這可能與超聲、微波聯(lián)合預(yù)處理大米蛋白，改善了大米蛋白本身的溶解度和構(gòu)象有關(guān)。

3 結(jié)論

本研究通過單因素試驗并在此基礎(chǔ)上進行了4因素3水平正交分析試驗，得到最佳工藝條件為超聲波功率500 W、攪拌速度500 r／min、作用時間20 min、微波加熱溫度55℃，在最優(yōu)條件下，ACE抑制率為90.70%。經(jīng)過超聲、微波聯(lián)合預(yù)處理大米蛋白，大米肽粗品的ACE抑制率可從65.44%提高到90.7%，此時大米肽粗品的IC50為0.226 mg／m L。因此，超聲、微波聯(lián)合預(yù)處理大米蛋白制備ACE抑制肽取得了較好的效果，這種方法具有廣闊的發(fā)展前景。

1 Ju Z Y，Hettiarachchy N S，Rath N.Extraction，denaturation and hydrophobic properties of rice flour proteins［J］.Journal of Food Science，2001，66（2）：229～232.

2 陳正行，姚惠源，周素梅.米蛋白和米糠蛋白開發(fā)利用［J］.糧食與油脂，2002（4）：6～9.

3 Hartmannr，Meisel H.Food－derived peptides with biological activity：from research to food applications［J］.Curr Opin Biotechnol，2007，18（2）：163～169.

4 黃家音，朱禹潔，沈金玉.降血壓肽研究進展［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2006，32（6）：81～86.

5 Lin F，Chen L，Liang R，et al.Pilot－scale production of low molecular weight peptides from corn wet milling byproducts and the antihypertensive effects in vivo and in vitro［J］.Food Chemistry，2011，124（3）：801～807.

6 尹歆，鄧放明.鰱魚蛋白制備ACE抑制肽的工藝優(yōu)化研究［J］.食品與機械，2012，28（2）：147～151.

7 Saito Y，Wanezaki K，Kawato A，et a1.Antihypertensive effects of peptide in sake and its byproducts on spontaneously hypertensive rat［J］.Biosci.Biotech.Biochem.，1994，58（5）：812～816.

8 Saito Y，Wanezaki K，Kawato A，et a1.Structure and activity of angiotensin I－converting enzyme inhibitory peptides from sake and sake lees［J］.Biosci.Biotech.Biochem.，1994，58（10）：1 767～1 771.

9 陳季旺，劉英，夏文水，等.大米降壓肽酶法制備工藝及其性質(zhì)研究［J］.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2007（5）：210～213.

10 He G Q，Xuan G D，Ruan H，et a1.Optimization of angiotensin I－converting enzyme（ACE）inhibition by rice dregs hydrolysates using response surface methodology［J］.Journal of Zhejiang University Science B，2005，6（6）：508～513.

11 馬海樂，郝志偉，何榮海，等.基于超聲預(yù)處理的大米降血壓多肽的制備及其功能評價［J］.中國食品學(xué)報，2010，10（6）：36～40.

12 胡子豪，鐘立人.如何提高食源性ACE抑制肽活性的探討［J］.食品與機械，2005，21（5）：67～80.

13 賈俊強，馬海樂，曲文娟，等.超聲預(yù)處理大米蛋白制備抗氧化肽［J］.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2008，24（8）：288～293.

14 陳衛(wèi)，范大明，馬申嫣，等.微波對蛋白質(zhì)及其衍生物結(jié)構(gòu)和功能的影響［J］.食品與生物技術(shù)學(xué)報，2012，31（3）：8～13.

15 姜倩倩，田耀旗，金征宇.超聲—微波處理對米飯品質(zhì)的影響［J］.食品工業(yè)科技，2013，34（12）：98～100.

16 王瑩，翟登攀，馬冬云，等.超聲波及微波提取豆粕中總黃酮的工藝優(yōu) 化 ［J］.佳 木斯 大 學(xué) 學(xué) 報 （自 然 科 學(xué) 版），2009，27（3）：468～470.

17 賈俊強，馬海樂，曲文娟，等.超聲預(yù)處理大米蛋白制備抗氧化肽［J］.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2008，24（8）：288～293.

18 蔡廣霞.大米源血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的復(fù)合酶法制備、純化及構(gòu)效關(guān)系研究［D］.武漢：武漢工業(yè)學(xué)院，2012.

19 王申，林利美，周佳，等.大米肽的絕對分子質(zhì)量與氨基酸組成及體外活性［J］.食品科學(xué)，2013，34（13）：19～23.

20 Mullally M M，Meisel H.Angiotensin I converting enzyme inhibitory activities of gastric and pancreatic proteinase digests of whey proteins［J］.International Dairy Journal，1997（7）：299～303.

21 Roy M K，Watanabe Y，Tamai Y.Yeast protease B－digested skim milk inhibits angiotensin－I enzyme activity［J］.Biotechnol Appl Biochem，2000，31（2）：95～100.

22 Urakaev F K，Boldyrev V V.Mechanism and kinetics of mechanochemical processes in comminuting devices：1.Theory［J］.Powder Technology，2000，107（1～2）：93～107.