底泥啤酒酵母分離純化與發(fā)酵性能測(cè)定

張 晶 岳媛媛

（1.三門峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品園林學(xué)院，河南 三門峽 472000；2.河南工業(yè)大學(xué)，鄭州 450001）

引言

啤酒酵母泥是啤酒后發(fā)酵過(guò)程中逐漸沉淀出來(lái)的老化或凋亡了的啤酒酵母體，是啤酒工業(yè)的主要副產(chǎn)物之一[1]。三門峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品園林學(xué)院現(xiàn)有生產(chǎn)型啤酒實(shí)訓(xùn)車間一個(gè)，配備有一套啤酒生產(chǎn)線，月啤酒生產(chǎn)量為1200L，由此所產(chǎn)生的啤酒酵母泥在40-80L左右，其中包含著大量啤酒酵母，可用于高活性啤酒酵母的選育。

啤酒酵母是啤酒生產(chǎn)中的重要原料菌，決定著啤酒的風(fēng)味與質(zhì)量[2]，目前我院原漿啤酒生產(chǎn)所用啤酒酵母購(gòu)自相關(guān)企業(yè)，生產(chǎn)成本高，且菌種特性不易掌控，因此，從底泥中選育活力強(qiáng)、發(fā)酵速度快、發(fā)酵力高的菌株有利于啤酒品質(zhì)控制及新產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)，并可降低生產(chǎn)成本。

因此，本研究選取啤酒后發(fā)酵過(guò)程中逐漸沉淀出來(lái)的啤酒酵母為材料，結(jié)合三門峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品園林學(xué)院啤酒投料生產(chǎn)時(shí)間，于2012年8月到11月間，對(duì)啤酒生產(chǎn)過(guò)程中所產(chǎn)生的啤酒底泥進(jìn)行收集，并進(jìn)行活性酵母的分離與選育，以獲得優(yōu)良酵母菌株，并對(duì)所分離酵母菌進(jìn)行啤酒發(fā)酵小試，測(cè)定發(fā)酵性能，確定是否適合發(fā)酵生產(chǎn)投加。

1 材料與方法

1.1 取樣

選用5L三角瓶，清洗后于121℃滅菌30分鐘，置于無(wú)菌環(huán)境中備用。

采用無(wú)菌取樣技術(shù)，從啤酒發(fā)酵罐底部收集發(fā)酵過(guò)程所產(chǎn)生的廢棄啤酒酵母底泥。置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 分離培養(yǎng)基配制

分離啤酒酵母所用培養(yǎng)基為PDA（馬鈴薯葡萄糖瓊脂）培養(yǎng)基。

a.成分

馬鈴薯 300g 葡萄糖 20g

瓊脂 20g 蒸餾水 1L

b.制法

將馬鈴薯去皮切塊，加1L蒸餾水，煮沸10-20分鐘，用紗布過(guò)濾，補(bǔ)加蒸餾水至1L，加入葡萄糖和瓊脂，加熱融化，分裝，115℃高壓滅菌20分鐘。

c.制備分離平板

采用無(wú)菌操作技術(shù)，將滅菌培養(yǎng)基趁熱倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，靜置凝固后備用。

d.平板分離

將酵母底泥經(jīng)過(guò)濾除雜、堿洗水洗除去表面吸附和夾雜的啤酒花，蛋白和顆粒雜質(zhì)，剩余酵母經(jīng)稀釋后制備成梯度稀釋液，選用10-6稀釋度菌液進(jìn)行平板涂布，置于28℃條件下培養(yǎng)3-5天。

1.3 酵母菌發(fā)酵性能測(cè)定

按照啤酒發(fā)酵工藝流程將所分離的啤酒酵母用于啤酒發(fā)酵小試[3]，通過(guò)發(fā)酵產(chǎn)物的理化指標(biāo)（糖度、菌體生長(zhǎng)，發(fā)酵力、菌株凝集性、死滅溫度）檢測(cè)其發(fā)酵性能，判定菌種是否適合發(fā)酵生產(chǎn)投加。

具體酵母擴(kuò)培及發(fā)酵操作流程：

a.原菌試管，液體試管活化

普通斜面試管可在無(wú)菌操作條件下，用接種環(huán)取1-2環(huán)菌苔接入10mL液體麥汁試管中活化一次。每四小時(shí)將試管在手掌心中敲擊80-100次。

b.平板分離

提前制備10-12°P的固體麥汁培養(yǎng)基，滅菌后無(wú)菌操作傾注平板，冷卻后從活化的液體麥汁試管無(wú)菌取樣，進(jìn)行平板畫線分離。接種時(shí)選擇生長(zhǎng)快，比較大，乳白色，邊緣整齊的正常菌落。

c.平板單菌落轉(zhuǎn)接

在分離平板中選擇4-6個(gè)單菌落，無(wú)菌操作，接入10mL液體麥汁試管中，搖動(dòng)至菌苔擴(kuò)散，培養(yǎng)24-36h，每4h將試管在手掌心敲擊80-100次。

從城區(qū)規(guī)模的階段性變化來(lái)看，南、西南、西以及西北向的城區(qū)規(guī)模自1999年～2014年，屬于穩(wěn)健發(fā)展，城區(qū)規(guī)模在逐步擴(kuò)展；對(duì)比東北、東以及東南向會(huì)發(fā)現(xiàn)：這3個(gè)方向在2011年以前的城區(qū)規(guī)模屬于有限的，但2011年以后的4期城市擴(kuò)展規(guī)模來(lái)看，屬于快速發(fā)展，尤其是東北向極為顯著。

d.逐級(jí)擴(kuò)培

由液體試管轉(zhuǎn)入250mL三角瓶、1L三角瓶、5L三角瓶逐級(jí)擴(kuò)培。擴(kuò)培容器裝量一般在55%-65%之間，麥汁濃度為12°P，提前滅菌備用。接種量保持在 1∶(8-10)，1∶(6-8)，1∶(4-6)， 培養(yǎng)溫度依次下降 1-2℃，培養(yǎng)時(shí)間在18-24h之間，每4h搖動(dòng)一次，每次1-2min，以充分吸氧，并將CO2釋出。

種酵母接入發(fā)酵罐后，與麥汁的比例不可大于1∶10，最好在 1∶3-5 左右。 保溫通氧發(fā)酵，直至主發(fā)酵結(jié)束后。

啤酒發(fā)酵工藝流程見(jiàn)圖1。

圖1 啤酒釀造工藝流程

2 結(jié)果與討論

2.1 酵母菌形態(tài)特征

根據(jù)平板菌落形態(tài)從中分離出高活性啤酒酵母一株。顯微鏡下菌體呈典型橢圓狀，出芽生殖明顯。平板及試管菌落形態(tài)見(jiàn)圖2，菌落大而飽滿，向上凸起，中間略有凹陷，直徑1-1.5cm，表面光滑潮濕，有光澤，乳白色，菌落正反面顏色一致，邊緣整齊。

圖2 底泥啤酒酵母菌落形態(tài)

將分散度良好、具有典型形態(tài)的菌落經(jīng)平板畫線分純后，挑取單菌落接種于PDA斜面培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)3-5天，菌體形成后置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2 酵母菌發(fā)酵性能測(cè)定

對(duì)分離到的酵母菌進(jìn)行逐級(jí)擴(kuò)培，由試管斜面→10ml試管→250ml三角瓶→1L三角瓶→5L三角瓶→300L發(fā)酵罐進(jìn)行麥芽汁發(fā)酵，并對(duì)發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行跟蹤檢測(cè)，根據(jù)菌種的發(fā)酵、產(chǎn)酸及啤酒的口感和風(fēng)味，綜合評(píng)價(jià)其發(fā)酵性能。

隨著發(fā)酵的進(jìn)行，酵母菌將利用自身代謝，將麥芽汁中的糖轉(zhuǎn)化為酒精，糖度逐步下降。對(duì)發(fā)酵前160小時(shí)發(fā)酵液中糖度變化進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測(cè)，降糖效果良好，具體糖度變化見(jiàn)表1和圖3。

表1 酵母菌發(fā)酵過(guò)程糖度變化

圖3 發(fā)酵過(guò)程糖度變化曲線

從發(fā)酵過(guò)程糖度變化曲線可以看到，所分離酵母菌在發(fā)酵過(guò)程有較好的降糖效果，發(fā)酵初期，降糖量較高，20小時(shí)單位降糖量在1.3-1.6BX，表明菌體生長(zhǎng)代旺盛，能快速利用糖分；后期趨于平穩(wěn)，20小時(shí)單位降糖量在0.3-1BX，經(jīng)連續(xù)7天培養(yǎng)后，穩(wěn)定在3.6BX，表明菌體進(jìn)入產(chǎn)物積累階段，總體降糖曲線顯示該酵母菌發(fā)酵能力強(qiáng)，代謝旺盛，發(fā)酵速度快。該研究結(jié)果與劉瀟[3]、易慶平[4]等研究結(jié)果一致，所分離菌株均表現(xiàn)出較強(qiáng)的降糖能力。

2.2.2 菌體生長(zhǎng)狀況

對(duì)發(fā)酵過(guò)程中酵母菌體生長(zhǎng)狀況進(jìn)行實(shí)時(shí)觀測(cè)，結(jié)果表明：

a.酵母菌在發(fā)酵前中期均呈典型的橢圓形，菌體形態(tài)均一，出芽生殖明顯，為典型的單端出芽，代謝活躍，發(fā)酵后期隨著衰亡期到來(lái)，發(fā)酵主過(guò)程結(jié)束，部分菌體形態(tài)發(fā)生變化，出現(xiàn)異常形態(tài)，但橢圓形仍為絕大部分酵母菌體存在的主流形態(tài)。

b.對(duì)不同發(fā)酵階段的發(fā)酵液進(jìn)行取樣、染色，鑒定酵母菌的死活性，結(jié)果經(jīng)美蘭染色后菌體均呈現(xiàn)無(wú)色，說(shuō)明發(fā)酵液中活性酵母菌占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，菌體生長(zhǎng)狀況良好，且純度高，無(wú)雜菌感染。

c.利用乳糖膽鹽發(fā)酵管對(duì)發(fā)酵液中是否存在大腸菌群進(jìn)行測(cè)定，乳糖膽鹽發(fā)酵管未出現(xiàn)變色、產(chǎn)氣現(xiàn)象，說(shuō)明發(fā)酵過(guò)程無(wú)大腸桿菌污染，發(fā)酵產(chǎn)物符合衛(wèi)生學(xué)標(biāo)準(zhǔn)要求。

2.2.3 發(fā)酵力測(cè)定

參照肖亞新[5]測(cè)定方法對(duì)所分離酵母菌進(jìn)行發(fā)酵力測(cè)定，所分離酵母菌CO2失重量見(jiàn)表2。

表2 酵母菌發(fā)酵過(guò)程CO2失重

從表2可以看出所分離菌株發(fā)酵70h時(shí)CO2失重達(dá)到9.3，是發(fā)酵速度較高的酵母。

2.2.4 菌株死滅溫度測(cè)定

參照劉瀟等[3]的測(cè)定方法對(duì)所分離菌株進(jìn)行死滅溫度測(cè)定。

表3 菌株死滅溫度測(cè)定

+：菌體生長(zhǎng)；-：菌體不生長(zhǎng)。

如表3所示：所分離酵母菌在52℃培養(yǎng)后不再繁殖，因此該酵母菌死滅溫度為52℃，耐熱性能良好。

2.2.5 菌株凝集性測(cè)定

采用本斯試驗(yàn)方法[6]測(cè)定菌株凝聚性，所分離酵母菌在三角瓶底部出現(xiàn)明顯的沉淀現(xiàn)象，離心后得到酵母沉淀0.8ml，凝集性較高。

2.2.6 小試發(fā)酵啤酒品質(zhì)檢驗(yàn)

利用所分離底泥啤酒酵母進(jìn)行啤酒小試發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后，酒液淡黃色，酒質(zhì)柔和，10℃下測(cè)得成品酒酒精度為3.4，泡沫豐富，掛壁良好，濃香醇厚，有明顯的麥芽香，苦味爽口，殺口力強(qiáng)，保持了本實(shí)訓(xùn)室傳統(tǒng)發(fā)酵啤酒的風(fēng)味，同時(shí)，與尹花等研究結(jié)果相吻合[7]。發(fā)酵成品見(jiàn)圖4。

圖4 啤酒小試成品酒

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)啤酒底泥中活性酵母菌進(jìn)行分離純化，得到一株高純度啤酒酵母菌，擴(kuò)大培養(yǎng)后用于啤酒發(fā)酵小試，通過(guò)對(duì)發(fā)酵過(guò)程的菌體生長(zhǎng)狀況、凝集性、死滅溫度、發(fā)酵力、降糖能力及成品酒感官檢驗(yàn)結(jié)果的跟蹤監(jiān)測(cè)，結(jié)果表明：所分離酵母菌菌種活性高，發(fā)酵力強(qiáng)，凝集性較高，死滅溫度達(dá)到52℃，降糖效果明顯，成品酒泡沫豐富，掛壁良好，濃香醇厚，出酒風(fēng)味優(yōu)良，保持了本實(shí)訓(xùn)室傳統(tǒng)發(fā)酵啤酒的風(fēng)味，為啤酒發(fā)酵的優(yōu)良菌株，可直接用于生產(chǎn)。

[1]衣龍海,郭玲玲,張巍，等.啤酒酵母泥的綜合利用[J].釀酒,2009(6)：86-87.

[2]杜丹,趙春燕.啤酒酵母泥綜合利用的研究動(dòng)態(tài)[J].技術(shù)研究,2006(8)：31-32.

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[5]肖亞新.啤酒廠酵母菌株篩選技術(shù)[J].食品工業(yè)科技，1999(4)：21-22.

[6]梁愛(ài)芬.淺談如何穩(wěn)定啤酒成品的發(fā)酵度[J].廣州食品工業(yè)科技，1994(3)：58-59.

[7]尹花,田玉紅,郝俊光，等.18種老化指示物質(zhì)在啤酒發(fā)酵過(guò)程中的變化研究[J].食品工業(yè)科技,2013(1)：63-66.