載銀水凝膠或載抗生素殼聚糖水凝膠在抑菌性能和細(xì)胞毒性方面的研究*

伍芳 何靜 吳堯 吳方*

論著·實(shí)驗(yàn)研究

載銀水凝膠或載抗生素殼聚糖水凝膠在抑菌性能和細(xì)胞毒性方面的研究*

伍芳 何靜 吳堯 吳方*

目的研究殼聚糖水凝膠，殼聚糖載銀水凝膠和殼聚糖載抗生素水凝膠短期的抑菌功效和細(xì)胞毒性。方法通過添加交聯(lián)劑后制備殼聚糖水凝膠，并有效裝載銀離子或硫酸慶大霉素。進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)和累計(jì)釋放實(shí)驗(yàn)了解殼聚糖基水凝膠的抗菌性能和藥物控釋性。通過使用材料的浸提液檢測這三種水凝膠的細(xì)胞毒性。結(jié)果抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明殼聚糖水凝膠，殼聚糖載銀水凝膠和殼聚糖載抗生素水凝膠均能有效抑制金黃色葡萄球菌的增殖。且殼聚糖載抗生素水凝膠具有最佳的抑菌性能且極大地抑制了生物膜的形成。體外藥物釋放顯示抗生素在7天內(nèi)的累計(jì)釋放多于60%；而銀離子的釋放低于10%。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明這三個(gè)凝膠材料無明顯細(xì)胞毒性。結(jié)論殼聚糖基水凝膠具有良好的短期抑菌效果，可降解，且無明顯細(xì)胞毒性，在骨科應(yīng)用方面有著巨大的前景。

殼聚糖；水凝膠；抑菌性能；細(xì)胞毒性

引言

目前骨科領(lǐng)域抑菌材料的研究主要集中在抑菌劑的持續(xù)釋放和長期抑菌效能[1-3]。然而，在非骨水泥型假體的置換應(yīng)用中，術(shù)后最初幾天的微生物感染風(fēng)險(xiǎn)最高，因而材料的短期抑菌性能更關(guān)鍵，而且抑菌成分的持續(xù)釋放有可能影響植入體材料的生物學(xué)功能。骨植入體的早期固定和新生骨的快速形成不僅對病人的早期康復(fù)很關(guān)鍵，而且也能增加人工骨的使用壽命。因此，構(gòu)建一種具有短期 (3～5天)抑菌效果和較低細(xì)胞毒性的生物材料在醫(yī)學(xué)研究和臨床治療等領(lǐng)域中具有極大的應(yīng)用前景。

殼聚糖(chitosan)具有較低的細(xì)胞毒性、可降解性、良好的抑菌性能，因而被廣泛使用在生物醫(yī)藥應(yīng)用方面[3-5]。最近，我們報(bào)道了在羥基磷灰石涂層表面覆著一層殼聚糖膜，在合適的濃度范圍內(nèi)，殼聚糖能兼顧優(yōu)良的生物相容性和良好的抑菌效果[4]。然而，該殼聚糖膜只在第一天內(nèi)對細(xì)菌有抑制作用，時(shí)間太短而缺乏實(shí)際的臨床應(yīng)用意義。水凝膠形式的殼聚糖能在3～5天內(nèi)抑制細(xì)菌增殖，且具有適當(dāng)?shù)慕到饴?，因而能有效解決上述問題。

在本研究中，我們選用水溶性殼聚糖，在京尼平的交聯(lián)作用下形成殼聚糖水凝膠，添加硝酸銀/硫酸慶大霉素等抗菌成分后制備得到載銀水凝膠和載抗生素水凝膠。系統(tǒng)而全面地測試這三種殼聚糖基材料的短期抑菌性能和細(xì)胞毒性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器及材料

酶聯(lián)免疫檢測儀 (Bio-Rad550)；電感耦合等離子體-原子發(fā)射光譜儀 (Thermo Scientific-IRIS Adv.)；UV-VIS分光光度儀(PerkinElmer-Lambda650)；SEM(S4800,HitachiLtd, Japan)；水溶性殼聚糖 (羧甲基殼聚糖，浙江澳興生物科技有限公司)；磷酸鹽緩沖溶液(PBS,Sigma)；硝酸銀(Sigma)；京尼平(臨川之信生物科技公司)；硫酸慶大霉素(GS,奧克生物科技有限公司）；二苯基四氮唑溴鹽 (MTT,Sigma)。

1.2 含有不同抑菌劑的殼聚糖水凝膠的制備與表征

用無菌超純水在無菌超凈臺里配置0.1 M AgNO3、2 wt %GS和3瓶50g/L的水溶性殼聚糖溶液。在其中兩瓶殼聚糖溶液中分別加入AgNO3，GS溶液，攪拌均勻。最后在3瓶殼聚糖溶液中均加入京尼平溶液，使得京尼平與殼聚糖的質(zhì)量比為1∶100。將配好材料在37°C放置24小時(shí)，形成凝膠。這三種材料分別用chitosan、chitosan-Ag+、chitosan-GS表示。以不含凝膠材料的空白孔作為空白對照組(control組)。使用尼康數(shù)碼相機(jī) (COOLPIX S70,Japan)記錄三種材料形成凝膠前后的形貌變化。

1.3 抑菌樣本制備

本研究選用金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus(ATCC 25923)評估已制備的三種凝膠材料的抑菌性能。在形成凝膠前，分別取0.5 ml樣品于24孔板中靜置24小時(shí)。其中以不含凝膠材料的空白孔作為空白對照組 (control組)。然后取1ml密度為1～2×106CFUs/ml的S.aureus菌液接種于凝膠材料上培養(yǎng)1、3、5天。然后在每孔中加入200 lMTT液，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后，加入1mlDMSO液，于波長490nm條件下在酶標(biāo)儀上測得吸光值 (OD值)。

1.4 菌體形貌研究

采用SEM對這三個(gè)樣品表面的細(xì)菌形貌進(jìn)行觀察。在培養(yǎng)1天后，將細(xì)菌樣品用2.5%的戊二醛固定過夜，經(jīng)過脫水、脫醇處理，噴金并觀察細(xì)菌形貌。

通過普通數(shù)碼相機(jī)觀察材料表面的細(xì)菌菌落形貌。將細(xì)菌培養(yǎng)在含有凝膠材料的直徑為35 mm的玻底皿中，其中以不含凝膠材料的空白玻底皿作為空白對照組(control組)。在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1、3、5天后，用普通相機(jī)觀察細(xì)菌生物膜的形成情況。

1.5 抑菌劑的釋放動(dòng)力學(xué)

分別取0.5ml載抗生素或載銀殼聚糖水凝膠于不同的離心管中，靜置24小時(shí)后。加入16mlPBS(pH=7.4)并置于恒溫?fù)u床，搖速和溫度分別保持在100 rpm和37°C。定時(shí)取出1 ml上清液，用離心管收集，并在釋放介質(zhì)中添加1 ml新鮮的PBS。使用UV-VIS分光光度儀(PerkinElmer-Lambda650)測量上清液中抗生素的含量。采用電感耦合等離子體-原子發(fā)射光譜儀 (Thermo Scientific-IRIS Adv.)測得銀離子的濃度。

1.6 體外浸提液毒性觀察

本文參照 ISO 10993-5的標(biāo)準(zhǔn)，對 chitosan、chitosan-Ag+、chitosan-GS進(jìn)行細(xì)胞毒性研究。按材料重量與浸提介質(zhì)體積為0.2g/ml的比例加入含10%血清的 -MEM(Hyclone)培養(yǎng)基，于37°C中浸提24小時(shí)。將此浸提原液與含10%血清的 -MEM培養(yǎng)基 (V/V=1∶0，V/V=1∶1，V/V=1∶3)混合，得到100%、50%、25%濃度的浸提液。取100l密度為50000個(gè)/ml的MC3T3-E1細(xì)胞懸浮液于96孔板培養(yǎng)24小時(shí)后，棄去培養(yǎng)液，用不同濃度的浸提稀釋液繼續(xù)培養(yǎng)1天。以含10%血清的 -MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)的細(xì)胞作為空白對照 (control組)。采用MTT法在490nm波長處，測得其吸光值。

2 結(jié)果

2.1 凝膠表征

在形成凝膠前，三種材料(chitosan、chitosan-Ag+、chitosan-GS)分別呈現(xiàn)淡黃色，乳白色和黃色(圖1，彩圖見插頁)。而在形成凝膠后，所有的樣品均轉(zhuǎn)變?yōu)樯钏{(lán)色或者灰色。

圖1 殼聚糖基樣品在形成凝膠前后的形貌:a形成凝膠前；b形成凝膠后(1)chitosan;(2)chitosan-Ag+;(3)chitosan-GS

2.2 抑菌性能分析

S.aureus在材料上培養(yǎng)1、3、5天后，這三個(gè)凝膠樣品組的OD值明顯低于空白組的OD值(圖2)，表明所制備的殼聚糖復(fù)合材料均有一定的抑菌行為。在殼聚糖水凝膠中添加抗菌劑后，抑菌性能顯著提高。在任意時(shí)刻，chitosan-GS樣品組的OD值最低。隨著時(shí)間的延長，chitosan組的吸光值逐漸降低。

圖2 三種不同凝膠體系的抑菌性能

3.3 細(xì)菌形貌分析

如圖3所示，空白孔表面有大量的金黃色葡萄球菌聚集而形成生物膜。載銀的殼聚糖水凝膠表面的細(xì)菌數(shù)量顯著降低，在載抗生素水凝膠上沒有發(fā)現(xiàn)細(xì)菌。

圖3 金黃色葡萄球菌在不同凝膠材料上培養(yǎng)一天的SEM圖。(a,e) control;(b,f)chitosan;(c,g)chitosan-Ag+;(d,h)chitosan-GS

如圖4所示（彩圖見插頁），空白孔中存在大量的白色的沉淀物 (即細(xì)菌菌落)。在實(shí)驗(yàn)的任意時(shí)間點(diǎn)，純的殼聚糖水凝膠上僅發(fā)現(xiàn)少量的白色沉淀，說明殼聚糖能抑制生物膜的形成。在第1天時(shí)，載銀水凝膠上沒有白色的沉積物，但在第5天時(shí)該樣品上開始出現(xiàn)白色沉淀。而載抗生素水凝膠組在1、3、5天時(shí)均沒有發(fā)現(xiàn)白色沉淀。以上的結(jié)果與MTT抑菌結(jié)果相符合，進(jìn)一步證實(shí)殼聚糖載抗生素水凝膠具有最優(yōu)的抑菌效果。此外，在第3天后，殼聚糖基水凝膠結(jié)構(gòu)開始降解。

圖4 金黃色葡萄球菌菌落在凝膠樣品上培養(yǎng)1、3、5天的形成情況。(a)control;(b)chitosan;(c)chitosan-Ag+;(d)chitosan-GS

3.4 抗菌劑的釋放動(dòng)力學(xué)分析

從累計(jì)釋放曲線可以看出(圖5，彩圖見插頁)，抗生素在84小時(shí)內(nèi)具有"突釋"效應(yīng)，藥物釋放速度較快，而后呈平穩(wěn)緩慢釋放，載抗生素水凝膠7天內(nèi)藥物釋放多于60%。與抗生素的釋放速率相比，銀離子的釋放相對緩慢。在7天內(nèi)，從殼聚糖水凝膠中釋放出來的銀離子不足10%。

圖5 抗生素和銀離子的累積釋放曲線

3.5 細(xì)胞毒性研究

從圖6所示，在100%濃度時(shí)，純的殼聚糖水凝膠組的OD值較空白對照組的OD值高，表明純的殼聚糖水凝膠組的浸提原液沒有細(xì)胞毒性。而空白組，殼聚糖載銀組和殼聚糖載抗生素組的細(xì)胞增殖能力并無明顯區(qū)別。隨著浸提原液稀釋后，這三種不同凝膠組的細(xì)胞增殖水平均高于空白組，表明了這三種材料無明顯細(xì)胞毒性。

圖6 凝膠材料不同浸提液濃度的細(xì)胞毒性研究。*表示樣品組相對空白對照組而言，具有顯著性差異(P＜0.05)

3 討論

京尼平是一種天然的生物交聯(lián)劑，能交聯(lián)含有氨基官能團(tuán)的生物聚合物 (如殼聚糖、硫酸慶大霉素)，其毒性遠(yuǎn)低于戊二醛[6]。chitosan樣品和chitosan-Ag+樣品在室溫下放置6個(gè)小時(shí)，便能觀測到凝膠的形成 (圖1b)，而 chitosan-GS需要約10個(gè)小時(shí)才能形成凝膠。原因可能在于京尼平與抗生素之間發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，形成深藍(lán)色物質(zhì)，從而降低了與殼聚糖交聯(lián)的京尼平含量，導(dǎo)致需要更長的時(shí)間形成殼聚糖基水凝膠。殼聚糖富含羥基和氨基官能團(tuán)，通過離子交換、吸附和螯合，殼聚糖能結(jié)合金屬離子[7]。我們選取的水溶性的堿性殼聚糖，能與AgNO3反應(yīng)形成乳白色的物質(zhì) (圖1a)。

MTT結(jié)果(圖2)、SEM結(jié)果(圖3)和生物膜形成結(jié)果(圖4)表明了殼聚糖基水凝膠極大地抑制了 S.aureus的增殖。殼聚糖的抑菌機(jī)理主要是通過其聚陽離子性能 (NH2+)損害細(xì)菌的細(xì)胞膜，從而有效抑制細(xì)菌[8]。添加Ag+或抗生素后，殼聚糖基水凝膠的抑菌性能顯著增強(qiáng)，且能明顯抑制細(xì)菌生物膜的行成。chitosan-GS樣品具有最佳的抑菌性能且能有效抑制生物膜的形成(長達(dá)5天)。隨著時(shí)間延長，純的殼聚糖水凝膠樣品的抑菌能力一直增加。很可能是因?yàn)槟z結(jié)構(gòu)的物理降解 (圖 4)，使得更多的殼聚糖的活性基團(tuán)(NH2+)暴露出來，增強(qiáng)了殼聚糖的抑菌能力。

釋放結(jié)果 (圖5)表明殼聚糖能有效裝載抗生素和銀離子。抑菌成分通過與京尼平或殼聚糖發(fā)生化學(xué)反應(yīng)共價(jià)結(jié)合，能在凝膠中能滯留更長時(shí)間。然而在第3天后，殼聚糖基水凝膠的結(jié)構(gòu)開始降解(圖4)。因此，采用可降解的殼聚糖在短期能 (3～5天內(nèi))極大地抑制S.aureus的增殖和生物膜的形成。在細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中(圖6)，所制備的這三個(gè)凝膠材料無明顯細(xì)胞毒性。

本文所制備的這三個(gè)凝膠樣品無明顯細(xì)胞毒性。殼聚糖載抗生素水凝膠具有最佳的抑菌效果，且能有效抑制金黃色葡萄球菌生物膜的形成?？傊?，具有短期抑菌性能和較低細(xì)胞毒性的殼聚糖基水凝膠在骨科應(yīng)用方面有著巨大的應(yīng)用前景。然而降低材料的細(xì)胞毒性僅是應(yīng)用于臨床的第一步，其次還需要提高植入體材料的生物相容性、骨結(jié)合能力等。該殼聚糖基水凝膠能賦予植入器械抑菌和較低細(xì)胞毒性兩大功效，可進(jìn)一步提高現(xiàn)有植入體的安全性和成功率，滿足臨床需要的短期抑菌效果。

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The research of Ag+or antibiotic loaded chitosan hydrogels on antibacterial efficacy and cytocompatibility

Wu Fang,He Jing,Wu Yao,et al.Engineering Research Center for Biomaterials,Sichuan University,Chengdu,610064, China

Objective Chitosan hydrogels,alone and with the loading of different antibacterial agents(Ag+and GS),were prepared in this study and their short-term antibacterial activity and cytotoxicity were systematically examined.Methods We selected water-soluble chitosan derivative formed hydrogel using genipin as the crosslinking agent,alone and with the additional incorporations of silver nitrate or gentamycin sulfate.We studied the cumulative release profile of antibacterial ingredients from the chitosan hydrogel.S.aureus was selected to systematically test the antibacterial efficacies and cytotoxicity of the three chitosan based antibacterial materials.Results The antibacterial tests showed that all three hydrogels achieved antibacterial activities on S.aureus,with the chitosan-GS hydrogel showing the best antibacterial efficacy and inhibition on biofilm formation.In vitro release showed that more than 60%of the entrapped antibiotics in hydrogel had been released,while less than 10%of the entrapped Ag+had been released within 7 days.The cytotoxicity tests also indicated all three materials were highly cytocompatible for MC3T3-E1 cells.Conclusion Chitosan based hydrogels have great potential in orthopedic applications,with combined short-term antibacterial efficacy,biodegradable and excellent biocompatibility on MC3T3-E1 osteoblasts.

Chitosan;Biofilm;Cytotoxicity

R318.08

A

10.3969/j.issn.1672-5972.2014.05.001

swgk2014-04-0057

伍芳(1989-)女，碩士研究生。研究方向:生物材料。

*[通訊作者]吳方(1972-)男，教授、博士生導(dǎo)師。主要研究方向:生物材料。

2014-04-11)

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(973計(jì)劃)(No.2012cb619103)；國家自然科學(xué)基金(No.31170922)；教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃(NCET-12-0387)；國家科技部支撐計(jì)劃項(xiàng)目(No.2012BAI17B06)資助

四川大學(xué)生物材料工程研究中心，四川成都610064