急性B淋巴細(xì)胞白血病病兒miR－21表達(dá)及意義

劉秀琴，于樹紅，孫立榮

（青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒科，山東 青島 266003）

急性B淋巴細(xì)胞白血病（B－ALL）是兒童常見急性白血病，病死率高，嚴(yán)重威脅病兒生命，迄今為止，其發(fā)病機(jī)制仍不明確？microRNA（miRNA）為一類由20～25個(gè)核苷酸組成的內(nèi)源性小分子非編碼單鏈RNA，主要參與基因轉(zhuǎn)錄后水平表達(dá)的調(diào)控［1］，其表達(dá)失調(diào)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用［2－5］。microRNA－21（miR－21）為重要的致癌基因，已有研究顯示，miR－21在T淋巴細(xì)胞白血病和 NK 細(xì)胞 白 血 病 中 高 表 達(dá)［6－7］，miR－21高 表 達(dá)與前B細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)病密切相關(guān)［8］。本研究用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法，檢測(cè)B－ALL病兒miR－21表達(dá)水平及其化療前后變化，探討其在兒童B－ALL發(fā)生、預(yù)后中的意義。

1 資料和方法

1.1 一般資料

2006年10月—2010年10月，取青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒科及青島市市立醫(yī)院小兒科初診BALL病兒36例，男15例，女21例；年齡1～14歲，平均7.5歲；其中高危型13例，標(biāo)危型23例。按細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫表型、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)（MICM）診斷標(biāo)準(zhǔn)確診，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)均為B－ALL。病兒均給予長(zhǎng)春新堿、柔紅霉素、左旋門冬酰胺酶和強(qiáng)的松（VDLP）方案化療，分別于化療前及化療后第2周末采集骨髓？臨床2個(gè)療程內(nèi)完全緩解（CR）者為體內(nèi)敏感；臨床2個(gè)療程不緩解者，骨髓白血病細(xì)胞下降指數(shù)（MBDI）≥60%為體內(nèi)敏感，＜60%為體內(nèi)耐藥。MBDI＝（化療前骨髓白血病細(xì)胞（%）－化療后骨髓白血病細(xì)胞（%））／化療前骨髓白血病細(xì)胞（%）×100%？以骨髓常規(guī)正常的非造血系統(tǒng)疾病病兒12例為對(duì)照組，近期未應(yīng)用過(guò)糖皮質(zhì)激素及其他免疫抑制劑，其中男8例，女4例；年齡1～12歲，平均6.5歲？

1.2 miR－21表達(dá)檢測(cè)

1.2.1 骨髓單個(gè)核細(xì)胞（BMMCs）的分離 取骨髓5mL，EDTA抗凝，用生理鹽水稀釋3～4倍，然后將其緩慢加至Ficoll淋巴細(xì)胞分離液4mL中（相對(duì)密度1.077），以2 000r／min離心16min？取界面層得BMMCs，用生理鹽水洗滌3次，以2×108／L的密度接種于含150g／L新生牛血清（Hyclone公司）的RPMI－1640培養(yǎng)液（美國(guó)GibcoBRL公司，內(nèi)含有100kU／L青霉素和100kU／L鏈霉素）中，置37℃、體積分?jǐn)?shù)0.05CO2和全濕條件下培養(yǎng)？

1.2.2 總RNA的提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)按Trizol（Invitrogen公司）試劑說(shuō)明書提取細(xì)胞總RNA，為增加miRNA獲得率，將異丙醇沉淀步驟改為－20℃沉淀2h以上。檢測(cè)RNA溶液吸光度（A）值，A260／A280值＞1.8方可用于檢測(cè)。加poly（A）尾后，應(yīng)用M－MLV反轉(zhuǎn)錄酶（Invitrogen公司）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以O(shè)ligo（dT）為引物，反應(yīng)條件如下：16℃30min，37 ℃ 30min，70 ℃ 10min，4 ℃10min。以制備的cDNA為模板，以U6作為內(nèi)參，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法在Roche定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，miR－21 上 游 引 物 為：5′－AAAGTTGTAGTCAGACTATTCGAT－3′，下游引物為：5′－GCTGTCAACGATACGCTACGT－3′。所有樣品做3個(gè)復(fù)孔，總反應(yīng)體系20μL，設(shè)定反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，55℃退火5s，72℃延伸15s。按照文獻(xiàn)［9］比較閾值法，讀取Ct值，用公式2－△△Ct計(jì)算目的基因miR－21的表達(dá)水平?！鳌鰿t＝（實(shí)驗(yàn)組 Ct目的基因－ 實(shí)驗(yàn)組 Ct管家基因）－ （對(duì)照組Ct目的基因－對(duì)照組Ct管家基因）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料結(jié)果用表示，數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

化療前B－ALL組miR－21表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異有顯著性（t＝20.75，P＜0.05）；B－ALL高危型組 miR－21表達(dá)水平為8.65±0.47，明顯高于標(biāo)危型組（5.23±0.35），差異有顯著性（t＝23.23，P＜0.05）；化療耐藥組 miR－21表達(dá)水平明顯高于化療敏感組，差異有顯著性（t＝10.12，P＜0.05）。化療后B－ALL組、化療敏感組miR－21表達(dá)水平較化療前明顯減低，差異有顯著性（t′＝10.56，t＝13.57，P＜0.05）；化療耐藥組化療前后 miR－21表達(dá)水平差異無(wú)顯著性（P＞0.05）。見表1。

表1 各組miR－21表達(dá)水平比較（）

表1 各組miR－21表達(dá)水平比較（）

化療前 化療后對(duì)照組 12 2.85±0.98 B－ALL組 36 7.06±0.43 5.24±0.94化療敏感組 30 6.69±0.49 4.59±0.61化療耐藥組組別 n 6 8.92±0.24 8.49±0.67

3 討 論

白血病發(fā)病存在細(xì)胞增殖失控、分化障礙及凋亡抑制等生物學(xué)特點(diǎn)，造血細(xì)胞惡性增殖、凋亡受抑是白血病發(fā)病的主要病理學(xué)機(jī)制，并決定著白血病病兒的臨床預(yù)后［10］？目前普遍認(rèn)為，miRNA與腫瘤細(xì)胞的增殖密切相關(guān)，這其中尤以miR－21的研究較多。由于miR－21是目前公認(rèn)的具有致癌作用的miRNA，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮樞紐調(diào)控效應(yīng)。已有研究結(jié)果表明，miR－21的過(guò)度表達(dá)與白血病、多發(fā)性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤和各種非血液系統(tǒng)實(shí)體腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移的能力和疾病預(yù)后有密切關(guān)系［6－8，11－15］；抑癌基因程序性細(xì)胞死亡因子4（PDCD4）可能是miR－21的靶基因，過(guò)表達(dá)的 miR－21能夠抑制PDCD4表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分化和增殖，并可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲、血管浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移［12－14］。進(jìn)一步的研究結(jié)果顯示，miR－21很可能是腫瘤耐藥的關(guān)鍵因素，與腫瘤預(yù)后密切相關(guān)，反義抑制miR－21能夠增加化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制［13］。其機(jī)制可能與 miR－21靶向作用PTEN，抑制P13K信號(hào)通路活化有關(guān)［16］。

本文研究結(jié)果顯示，B－ALL病兒miR－21表達(dá)明顯增高，其中高危型組miR－21表達(dá)明顯高于標(biāo)危型組，化療后miR－21表達(dá)較化療前降低，與文獻(xiàn)結(jié)果相符，提示miR－21在兒童B－ALL的發(fā)病中發(fā)揮著重要的致癌基因作用。本文研究結(jié)果還顯示，B－ALL病兒化療后miR－21表達(dá)水平降低，以化療敏感組最為明顯，化療耐藥組miR－21表達(dá)化療前后無(wú)明顯改變；化療耐藥組化療前miR－21表達(dá)顯著高于化療敏感組，提示miR－21過(guò)表達(dá)可能為兒童B－ALL的不良預(yù)后指標(biāo)，與兒童B－ALL疾病預(yù)后有密切關(guān)系，miR－21過(guò)表達(dá)與兒童B－ALL白血病細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移能力以及疾病預(yù)后有密切關(guān)系，可作為兒童B－ALL預(yù)后判斷指標(biāo)。但具體的機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

綜上所述，miR－21通過(guò)對(duì)靶基因的調(diào)控調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、增殖和凋亡，其表達(dá)增高參與了腫瘤細(xì)胞的侵襲、血管浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，miR－21靶向藥物可能成為治療腫瘤的一種行之有效的方法，與抗腫瘤藥物聯(lián)合應(yīng)用將是腫瘤治療的一個(gè)新方向，也是提高療效的關(guān)鍵。

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