HPLC法測定阿扎胞苷原料藥中的有關(guān)物質(zhì)

鄒泓，李邇娜，武婷婷，楊義芳，狄斌

1中國藥科大學(xué)藥物分析教研室，南京 210009；2南京圣和藥業(yè)股份有限公司，南京 210038

HPLC法測定阿扎胞苷原料藥中的有關(guān)物質(zhì)

鄒泓1，2，李邇娜2，武婷婷2，楊義芳2，狄斌1*

1中國藥科大學(xué)藥物分析教研室，南京 210009；2南京圣和藥業(yè)股份有限公司，南京 210038

目的：建立阿扎胞苷有關(guān)物質(zhì)的HPLC測定方法。方法：采用Waters Atlantis T3柱（150 mm×4.6 mm，3 μm）對降解雜質(zhì)和工藝雜質(zhì)進行定量分析。以磷酸二氫鉀緩沖液（pH=6.5）-60%乙腈為流動相，梯度洗脫；檢測波長為214 nm。結(jié)果：主峰與各雜質(zhì)峰間能達(dá)到基線分離。阿扎胞苷濃度在0.271～16.242 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系（r=0.9999），最低檢測限為150 ng·mL-1。結(jié)論：應(yīng)用高效液相色譜法選擇性高、重現(xiàn)性好，可作為阿扎胞苷質(zhì)量控制的方法。

HPLC法；阿扎胞苷；有關(guān)物質(zhì)

阿扎胞苷，化學(xué)名：4-氨基-1-（（2R，3R，4S，5R）-3，4-二羥基-5-（羥甲基）四氫呋喃-2-基）-1，3，5-三嗪-2（1H）-酮（結(jié)構(gòu)見圖1），分子式為C8H12N4O5，分子量為244.20。由Pharmion制藥公司研制開發(fā)，于2004年5月在美國批準(zhǔn)上市，是第一個骨髓增生異常綜合征的治療藥物[1]。

目前，阿扎胞苷原料及其制劑未在國內(nèi)上市。有關(guān)該藥的測定方法，美國藥典標(biāo)準(zhǔn)草案結(jié)合反相液相色譜法和親水色譜法兩種方法測定其有關(guān)物質(zhì)[2]，方法中僅對單個降解雜質(zhì)與起始原料進行控制。該方法存在控制的降解雜質(zhì)個數(shù)少，也未對工藝雜質(zhì)進行定量分析等問題。

圖1 阿扎胞苷結(jié)構(gòu)式

本研究根據(jù)合成工藝，采用反相液相色譜法，可以更好地檢測及控制阿扎胞苷原料藥的有關(guān)物質(zhì)，所測4批樣品的有關(guān)物質(zhì)中含N-甲酰脒基核糖基脲異構(gòu)體之和不超過1.0%，含脒基核糖基脲異構(gòu)體之和不超過0.5%，其他單個雜質(zhì)不超過0.1%，總雜不超過2.0%。該方法簡便準(zhǔn)確，專屬性好，能滿足質(zhì)量控制和穩(wěn)定性考察要求。

1 材料

1.1 儀器

Agilent1260液相色譜儀（真空脫氣機，二元泵，自動進樣器，G4212B DAD檢測器和ChemStation色譜工作站）；Mettler toledo電子天平（XS105）。

1.2 試劑

阿扎胞苷原料（南京圣和藥業(yè)有限公司，批號：S201302281、S201304201、S201304301、S201305121）；阿扎胞苷對照品（由原料藥精制而得，經(jīng)紫外、紅外、質(zhì)譜和核磁共振分析確證，批號：20130305，純度：99.57%）及各雜質(zhì)對照品（降解雜質(zhì)：N-甲酰脒基核糖基脲，A雜，純度94.46%；脒基核糖基脲，B雜，純度90%；阿扎胞苷異構(gòu)體，C雜，純度97.77%。工藝雜質(zhì)：6-氨基-5-氮雜胞嘧啶，D雜，純度96.02%；單乙酰阿扎胞苷，E雜，純度98.72%。合成中間體，F(xiàn)雜，純度99.50%），除B雜為USP標(biāo)準(zhǔn)品外，其余均為自制，且經(jīng)過質(zhì)譜與核磁共振分析確證。甲醇、乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純；試驗用水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Atlantis T3（4.6 mm×150 mm，3 μm）；流動相：以0.02 mol·L-1磷酸二氫鉀緩沖液（pH值6.5）為流動相A、以流動相A-乙腈（40∶60）為流動相B，進行梯度洗脫（見表1）；檢測波長：214nm；柱溫：25℃；自動進樣器溫度：5℃；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：5 μL。

稀釋溶劑：稱取磷酸二氫鉀6.8 g，亞硫酸氫鈉5 g，加水溶解成1000mL，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.0。

表1 洗脫梯度

2.2 有關(guān)物質(zhì)測定方法

取本品4批原料，精密稱定，加稀釋溶劑溶解并稀釋成每1 mL中含阿扎胞苷0.5 mg的溶液，作為供試品溶液；精密量取供試品溶液適量，用稀釋溶劑制成每1 mL中含阿扎胞苷0.5 μg的溶液，作為主成分自身對照溶液。

照“2.1”項下色譜條件，取對照溶液5 μL注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)儀器靈敏度，使主成分色譜峰的峰高約為滿量程的10%，再精密量取供試品溶液和對照溶液各5 μL，分別注入色譜儀，記錄色譜圖。供試品溶液色譜圖中如有雜質(zhì)峰，按加校正因子的主成分自身對照法以峰面積計算，即得。

2.3 專屬性試驗

取阿扎胞苷對照品及A雜、B雜、C雜、D雜、E雜、F雜各適量，精密稱定，加稀釋溶劑制成每1 mL中含阿扎胞苷500 μg、各雜質(zhì)5 μg的混合溶液，進樣分析，見圖2。結(jié)果表明，在上述色譜條件下阿扎胞苷主峰與各雜質(zhì)峰能達(dá)到良好分離，雜質(zhì)間的分離度均不小于1.5。

圖2 阿扎胞苷分離度色譜圖

另取阿扎胞苷原料（批號：S201302281）約10 mg，稱取7份，分別置20 mL量瓶中，進行不同條件下的降解試驗，試驗條件依次為（A）未經(jīng)破壞樣品；（B）加0.1 mol·mL-1鹽酸2 mL、室溫放置15 min后中和；（C）加0.01 mol·mL-1氫氧化鈉溶液2 mL后立即中和；（D）加10%過氧化氫溶液0.5 mL、室溫放置3 h；（E）加稀釋溶劑20 mL，60℃加熱10 min；（F）60℃加熱24 h；（G）2400 Lx光照24 h。6種條件下的樣品均用稀釋溶劑稀釋至刻度。按“2.1”項下色譜條件測定上述溶液。色譜圖見圖3。

圖3 阿扎胞苷降解色譜圖

從圖3表明，本品在溶液狀態(tài)下，對酸、堿、氧化、高溫均有不同程度的降解，降解產(chǎn)物均在14 min前出峰，A雜、B雜顯著增加，在氧化及高溫溶液條件下，還伴有少量C雜的產(chǎn)生，其他未知雜質(zhì)增加不明顯。在酸破壞條件下，本品主要降解為A雜，有關(guān)物質(zhì)按面積歸一化法計算為7.59%；在堿破壞條件下，有關(guān)物質(zhì)為18.67%，說明阿扎胞苷在堿性條件下更不穩(wěn)定；在氧化破壞條件下，本品主要降解產(chǎn)生B雜，有關(guān)物質(zhì)為11.04%；在高溫溶液條件下，本品產(chǎn)生的雜質(zhì)峰較多，在保留時間為5.021、7.262、8.460、12.757 min均產(chǎn)生未知雜質(zhì)峰，有關(guān)物質(zhì)為19.35%。本品在固體狀態(tài)下，對高溫、光照較穩(wěn)定，雜質(zhì)個數(shù)、總量無明顯變化。在60℃加熱條件下，有關(guān)物質(zhì)為0.26%；在光照條件下，有關(guān)物質(zhì)為0.30%。

上述條件下，各雜質(zhì)峰與主峰均能良好分離，主峰純度高，物料保持平衡，說明此方法專屬性好，能夠有效檢測樣品中的降解產(chǎn)物。

2.4 線性關(guān)系考察

精密稱取阿扎胞苷對照品和各雜質(zhì)對照品適量，分別用稀釋溶劑溶解并逐步稀釋制成系列濃度的溶液。按“2.1”項下色譜條件測定，由溶液濃度（C）對峰面積（A）做線性回歸，所得方程及其校正因子見表2。

2.5 檢測限和定量限

取阿扎胞苷對照品和各雜質(zhì)對照品適量，分別配成每1 mL中含0.5 mg的溶液，分別吸取溶液適量，用稀釋溶劑逐級稀釋，進樣分析，按信噪比S/N= 3計算檢測限；按信噪比S/N=10計算定量限。結(jié)果見表2。

2.6 精密度試驗

取“2.4”項下阿扎胞苷及各雜質(zhì)的限度濃度溶液，按“2．1”項下色譜條件測定，連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖，按主峰峰面積計算，RSD值均小于2%。

表2 線性關(guān)系和檢測限、定量限結(jié)果

2.7 穩(wěn)定性試驗

取阿扎胞苷對照品適量，按“2．2”項下方法制成供試品溶液，分別在室溫及5℃條件下放置，于0、1、2、3、4、5 h測定，照“2．1”項下色譜條件進樣分析。結(jié)果表明：待測溶液在室溫下放置，主峰面積顯著下降，降解雜質(zhì)的個數(shù)和含量均有所增加；在5℃下放置，溶液較為穩(wěn)定，雜質(zhì)的量增加較少，主峰面積RSD為0．42%，提示待測溶液應(yīng)在5℃下現(xiàn)配進樣。

2.8 有關(guān)物質(zhì)樣品測定

取阿扎胞苷4批原料適量，依法測定其有關(guān)物質(zhì)，結(jié)果見表3。

3 討論

3.1 流動相與色譜柱的選擇

阿扎胞苷及其降解雜質(zhì)為親水性化合物，流動相起始有機相比例對阿扎胞苷的保留時間影響較大，以純水相為起始比例的流動相組成，主峰阿扎胞苷保留時間適宜，雜質(zhì)間分離度均不小于1．5。比較Agilent Zorbax RX-C8等色譜柱，B雜與D雜分離效果差，且峰形易拖尾，故選用耐水系列Waters Atlantis T3色譜柱，使用壽命長。

表3 有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果

3.2 稀釋溶劑、添加劑與pH的選擇

由于阿扎胞苷易水解[3]，故在溶劑中添加亞硫酸氫鈉，以防止其過快分解；又考察了不同pH下的溶液穩(wěn)定性，綜合色譜柱pH的耐受范圍，采用pH= 3．0的稀釋溶劑時，阿扎胞苷分解較慢。

[1] CelgeneCorporation．Vida zaprescribinginformation [EB/OL]．(2012-04-09)．http://www．vidaza．com/pdf/PI_FINAL．pdf

[2] The United States Pharmacopeia．C98278,USP Pending Monograph Draft 1-For Public Comment[S]．2012．

[3] Kissinger LD,Stemm NL．Determination of the antilekemia agents cytarabine and azacitidine and their respectivedegradationproductsbyhigh-performance liquid chromatography[J]．J Chromatogr,1986,353: 309-18．

Determination of the Related Substances of Azacitidine by HPLC

ZOU Hong1,2,LI Er-na2,WU Ting-ting2,YANG Yi-fang2,Di Bin1*
1Department of Pharmaceutical Analysis,China Pharmaceutical University,Nanjing 210009;2Nanjing Sanhome Pharmaceutical Co.,Ltd.,Nanjing 210038,China

Objective：To establish a HPLC method for the determination of the related substances of azacitidine．Methods：The separation for degradation and process impurities was based on a Waters Atlantis T3(150 mm×4．6 mm,3 μm)column;the Mobile phase contisted of potassium dihydrogen phosphate solution(adjust to pH 6．5)-60%acetonitrile with gradient elution;the detective wavelength was 214 nm．Results：The chief peak and every impurity peak were separated well．A good linearity for azacitidine was obtained over the range of 0．2707～16．2420 μg·mL-1(r=0．9999),the LOD was 150 ng·mL-1．Conclusion：This highly selective and reproducible HPLC method offers an option in the quality control of azacitidine．

HPLC;Azacitidine;Related substances

R927.11

A

1673-7806（2014）06-516-03

鄒泓，男，碩士生，研究方向：藥物分析 E-mail:zouhong199107@126.com

*通訊作者 狄斌，男，教授，研究方向：藥物分析 E-mail:dibin@cpu.edu.cn

2014-06-06

2014-06-17