補陽還五湯對缺血大鼠腦組織形態(tài)及GFAP表達的影響

摘要：目的 探討陽還五湯對大鼠大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery occlus ion，MCAO）模型不同時期梗死區(qū)組織形態(tài)及膠原纖維酸性蛋白（GFAP）表達的影響。方法 采用線栓法制作大鼠MCAO模型，并隨機分為1、3、7、14、21、28 d組。采用HE染色、免疫組化觀察組織形態(tài)及指標的變化。結果 補陽還五湯治療7 d后GFAP達高峰，其陽性表達明顯多于模型組，后細胞數(shù)量減少。結論 補陽還五湯能夠促進大鼠腦梗死區(qū)域GFAP增殖，提高大鼠神經(jīng)功能、改善腦組織缺血，具有一定動員內源性神經(jīng)干細胞歸巢缺血腦組織的作用。

關鍵詞：陽還五湯；大鼠大腦中動脈閉塞模型；膠原纖維酸性蛋白

腦梗死又稱缺血性腦卒中，發(fā)病率110/10萬，占全部腦卒中的60%～80%，腦梗死作為我國第二大死亡病因，具有高發(fā)病率、高死亡率、高致殘率的特點[1]。

腦缺血后反應性星形膠質細胞增生并產(chǎn)生膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP），急性期反應性膠質細胞增生具有神經(jīng)保護作用，而后期可形成疤痕組織影響神經(jīng)元的修復[2]。

1資料與方法

1.1一般資料

1.1.1動物 清潔級雄性健康SD雄性大鼠240只，體重250～300 g，購自廣西醫(yī)科大學（動物合格證號：SCXK桂2009-0002）。將動物隨機分為模型組、補陽還五湯治療組，每組又設1、3、7、14、21、28 d 6個時間點。每個時間點10只大鼠。所有大鼠在同規(guī)格動物房中飼養(yǎng)，溫度（25±1）℃，濕度（50±10）%，光暗周期12 h/12 h，常規(guī)環(huán)境適應性飼養(yǎng)7 d后進行試驗。

1.1.2中藥制備 藥物制備補陽還五湯按王清任《醫(yī)林改錯》原方組成：黃芪120 g，當歸6 g，赤芍4.5 g，川芎3 g，紅花3 g，桃仁3 g，地龍3 g，上述生藥材均符合《中國藥典》相關規(guī)定。藥材去除雜質切制后，加入生藥材10倍量的水，浸泡60 min，用TC-15套式恒溫器250V電壓加熱煎煮。沸騰后將電壓調低至150V，保持微沸狀態(tài)煎煮1 h，濾取煎液。藥渣再加入生藥材8倍量的水，同法煎煮1h，濾取煎液。合并2次煎液，于恒溫水浴鍋（100℃）蒸發(fā)去水分至濃稠狀，入恒溫烘箱（60℃）干燥，得干浸膏，稱重，收膏率為36.80%，4℃保存，備用。灌胃時用蒸餾水溶解浸膏至生藥材含量為2.0 g/mL。

1.1.3給藥方法 參考徐叔云教授主編的《藥理實驗方法學》第三版） 灌胃，大鼠的等效劑量相當于成人用量的6.3倍，2次/d，每次（生藥7.48 g/Kg），其他組給予等體積的無菌蒸餾水，灌胃至造模后1、3、7、14、21、28 d 6個時間點處死。

1.2方法

1.2.1大腦中動脈閉塞（MCAO）模型制作 參照Longa[3]線栓法制作MCAO模型。將大鼠麻醉，仰臥固定，做頸部縱行切口，暴露并鈍性游離右側頸總動脈（CCA）、頸內動脈（ICA）及頸外動脈（ECA），結扎CCA近心端、頸外動脈近分叉部，并充分游離ICA。沿ICA方向插人直徑0.22 mm尼龍線至有阻力感并輕微彎曲為止，于ICA近心端結扎該動脈，并全層縫合切口。按照Benerson標準，動物蘇醒后，凡具有下列4項體征則表示模型制作成功，納入研究對象：①提尾時左前肢內收屈曲（即提尾懸空實驗陽性）；②右眼Horner征；③爬行時向左劃圈；④站立時向左側傾倒。模型組及補陽還五湯高、中、低劑量治療組均進行大腦中動脈閉塞（MCAO）模型制作，假手術組除不進行大腦中動脈線栓外，其余操作均同模型組，對照組不做任何處理。

1.2.2大鼠神經(jīng)功能學評分 大鼠造模清醒后采用Longa[3]評分標準 0分：無神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)；1分：對側前爪不能充分伸展；2分：向外側轉圈；3分：行走時向對側傾斜；4分：不能行走，意識喪失） 進行神經(jīng)功能評分，1～3分者納入實驗，0分、4分者剔除。

1.2.3腦梗死組織HE染色 各組各時間點大鼠均常規(guī)HE染色，光鏡下進行病理觀察。2.5%戊二醛溶液、1%鋨酸固定，常規(guī)制作超薄切片，經(jīng)醋酸鈾及檸檬酸鉛雙染色后，透射電鏡下觀察梗死區(qū)域神經(jīng)元、星形膠質細胞、少突膠質細胞和毛細血管等超微結構。

1.2.4免疫組化觀察大鼠腦組織病理形態(tài)學 各組大鼠于造模后1、3、7、14、21、28 d 6個時間點隨機各取6只大鼠經(jīng)10%水合氯醛麻醉后開胸，經(jīng)升主動脈插管，先用生理鹽水150 mL快速沖洗，繼而灌注4%多聚甲醛300 mL，灌注后取腦，在4℃下將腦移入4%多聚甲醛固定6 h，然后移入30%蔗糖液中沉底。行冠狀切面切片，厚2 um。各組大鼠6個時間點將標本制備后均進行免疫組化染色。

2結果

2.1 HE染色初步觀察各組腦組織形態(tài) HE染色法主要觀察神經(jīng)細胞數(shù)、微血管數(shù)、炎性細胞數(shù)、陽性細胞數(shù)（出現(xiàn)核固縮、核破裂的神經(jīng)元），從以上指標的改變來探討腦梗死的機制，見圖1～4。

HE染色結果分析：術后3 d時，模型組皮層組織梗死中心區(qū)神經(jīng)元、膠質細胞和血管大量壞死，可見少量皺縮神經(jīng)元和小膠質細胞、細胞骨架消失或嚴重破壞，組織結構疏松呈篩網(wǎng)狀，軟化灶明顯，梗死灶周邊區(qū)部分神經(jīng)元腫脹，胞漿伊紅著色變淺，形態(tài)變圓，體積增大，分布不均，另一部分神經(jīng)元濃縮，核周質濃縮著色較深，被空泡的神經(jīng)纖維圍繞，神經(jīng)元形態(tài)變?yōu)槎嘟切位蛏刃?，血管可見粒細胞附壁及浸潤；假手術組與補陽還五湯組的梗死范圍明顯小于模型組，梗死邊緣組織結構未完全破壞，殘存神經(jīng)元較多，周圍散在膠質細胞增生，神經(jīng)元、膠質細胞和血管大量變性壞死等缺血性改變和炎性反應明顯輕于模型組。術后7 d時，模型組較術后3 d時的表現(xiàn)有好轉趨勢，膠質細胞增生，細胞數(shù)目有所增多。術后28 d時，模型組膠質細胞明顯增生，細胞數(shù)目增多。假手術組與補陽還五湯組術后7 d、28 d時，病理形態(tài)改變顯著輕于同期模型組。

2.2補陽還五湯對腦梗死組織中GFAP表達的影響，見圖5～6。

大鼠腦組織GFAP的表達：GFAP細胞主要聚集在梗死區(qū)周圍，隨時間的推移其陽性細胞數(shù)逐漸增多，胞體增大，突起多且粗大，7 d達高峰；而后細胞數(shù)量減少，胞體較小且細胞突起變少而纖長。其中治療組在術后7 d GFAP陽性表達明顯多于模型組。

2.3治療后神經(jīng)功能缺損評分 治療組、模型組在各個時間點處死前分別進行神經(jīng)功能評分，其中，治療組神經(jīng)功能評分平均為（1.41±0.53），評分明顯低于模型組（2.79±0.82），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

3討論

腦梗死屬于缺血性腦卒中的一種，目前中藥治療腦梗死已經(jīng)廣泛運用于臨床，并取得較好的臨床療效。本課題中涉及的補陽還五湯，作為臨床治療腦梗死療效確鑿的古方近年來科研工作者進行了較為廣泛的研究。神經(jīng)再生是指干細胞分化產(chǎn)生新神經(jīng)元的過程，包括干細胞動員、增殖；移行、歸巢；神經(jīng)分化3個環(huán)節(jié)。神經(jīng)干細胞在進行自身增殖、移行、分化過程中表達特定的細胞因子、蛋白成分， GFAP是星形膠質細胞的特征性標志物，是新增殖神經(jīng)干細胞表達的一個重要成分。劉氏等[4]采用線栓法復制大鼠腦缺血模型，運用免疫組織化學方法檢測腦缺血后各組NSCs的激活。結果表明局灶性腦缺血后，NSCs激活、增殖，補陽還五湯能促進NSCs的增殖，作用機制可能與其能調控微血管舒縮功能，改善大腦血供有關。高氏等[5]研究補陽還五湯對老齡大鼠腦缺血再灌注海馬齒狀回細胞增殖分化影響，結果表明補陽還五湯抗腦缺血再灌注損傷的機制與其促進海馬齒區(qū)神經(jīng)干細胞增殖、分化有關。譚氏等[6]研究補陽還五湯對缺血性腦卒中后遺癥大鼠神經(jīng)增殖作用影響，結果表明補陽還五湯對缺血性腦卒中后遺癥大鼠神經(jīng)增殖具有促進作用。佟氏等[7]研究補陽還五湯及不同配伍組方對缺血性腦中風后大鼠神經(jīng)增殖作用的對比影響。GFAP是星形膠質細胞的標志蛋白，在星形膠質細胞中有豐富的、唯一的表達，可以作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后星形膠質細胞反應增生的標志。

經(jīng)以上研究發(fā)現(xiàn)，補陽還五湯對大鼠缺血缺氧性腦組織內源性神經(jīng)干細胞的增殖及內源性神經(jīng)干細胞的遷移分化有一定促進作用，但其作用機制有待進一步研究。

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編輯/肖慧