宮頸鱗癌中RhoA及CD34的表達(dá)及臨床意義

摘要：目的 探討RhoA及微血管密度（MVD）與宮頸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。方法 采用免疫組織化學(xué)SP法，分別測定16例正常宮頸組織、20例宮頸上皮內(nèi)瘤變組織、50例宮頸鱗癌組織中RhoA蛋白及CD34的表達(dá)。結(jié)果 ①宮頸鱗癌組RhoA的陽性表達(dá)與宮頸上皮內(nèi)瘤變組和正常宮頸組比較有明顯差異（P<0.001；P<0.001）。②宮頸鱗癌組MVD值與宮頸上皮內(nèi)瘤變組和正常宮頸組比較有明顯差異（P<0.001；P<0.001）。③Ⅱ期宮頸鱗癌RhoA和MVD的陽性表達(dá)分別與Ⅰ期比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。組織學(xué)分級G3 RhoA和MVD的陽性表達(dá)分別與G1RhoA和MVD比較有明顯差異（P<0.05）。宮頸鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組RhoA的陽性表達(dá)與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組比較，無明顯差異（P>0.05），MVD比較也無差異（P>0.05）。<35歲的年輕宮頸癌患者中RhoA的陽性表達(dá)率與≥35歲的宮頸癌患者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。兩組患者M(jìn)VD值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中，RhoA的表達(dá)增強(qiáng)和MVD增高可能發(fā)揮了重要作用。

關(guān)鍵詞：宮頸癌；RhoA；CD34；微血管密度；腫瘤轉(zhuǎn)移

The Expression of RhoA and CD34 in Cervical Squamous Cell Carcinoma and Clinical Significance

ZHANG Ping1，DAI Juan2，F(xiàn)AN Ling-hua1，MAO Xi-guang1

（1.Department of Obstetrics and Gynecology，The Affiliated Hospital of Luzhou Medical College，Luzhou 646000，Sichuan，China；2.Department of Obstetrics and Gynecology，Panzhihua City Central Hospital，Panzhihua 617000，Sichuan，China）

Abstract：Objective To estimate the expressions of RhoA and microvessel density（MVD）in squamous carcinoma of the cervix（SCC）， cervical intraepithelial neoplasia （CIN） and normal cervical epithelium（NCE） and evaluate the possible mechanism in the invasion of cervical carcinoma. Methods In 16 NCE cases，20 CIN cases and 50 SCC cases， immunohistochemical S-P method had been used to examine the expression levels of RhoA and CD34. Results ①The expression level of RhoA was significantly higher in SCC than in CIN and NCE（P<0.001，P<0.001）.② The MVD was significantly higher in SCC than in CIN and NCE（P<0.001， P<0.001）.③ In comparison to stage ⅠSCC， the expression levels of RhoA and MVD in stage Ⅱ were significant difference（P<0.01；P<0.01）. In comparison to G1 SCC， the MVD and the expression levels of RhoA in G3 had significant difference（P<0.05；P<0.001）. In comparison to the without lymph nodal metastasis group， the expression levels of RhoA and MVD in SCC with lymph node metastasis group was no significantly different（P>0.05；P>0.05）. The expression levels of RhoA in more than 35 years old was higher than in less than 35 years old， there was significant difference（P<0.001）， but MVD was no significantly different in the two groups（P>0.05）. Conculusion RhoA might be a key role in the invasion and metastasis of squamous carcinoma of the cervix. The increase of microvessel density is closely related to the progression of tumor. Their levels maybe act as clinical referential indexes in the progression of cervical carcinoma.

Key words：Cervical cancer； RhoA； CD34； Microvessel density； Neoplasm metastasis

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，每年新增宮頸癌患者80%發(fā)生于發(fā)展中國家[1]，目前其發(fā)病還有年輕化趨勢[2]。宮頸癌的主要特點(diǎn)是侵襲轉(zhuǎn)移，這也是導(dǎo)致宮頸癌患者死亡的主要原因。近年研究發(fā)現(xiàn)一些與宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因如Rho[3-4]等在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用。本研究采用免疫組化SP法檢測RhoA和CD34在宮頸癌組織中的表達(dá)情況，探討RhoA表達(dá)改變及微血管密度與宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1資料與方法

1.1一般資料 標(biāo)本取自2010年1月～2012年12月在我院婦科手術(shù)切除宮頸病理組織標(biāo)本，其中宮頸上皮內(nèi)瘤變組織20例；宮頸鱗癌標(biāo)本50例（淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移者16例，淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移者34例）；鱗癌組織學(xué)分級：G1 27例，G2 13例，G3 10例；FIGO分期：Ⅰ期31例，Ⅱ期19例。隨機(jī)選擇16例同期因子宮肌瘤行全子宮切除的正常宮頸標(biāo)本作對照?；颊吣挲g27～65歲，中位年齡43.4歲。全部病例術(shù)前均未接受放療、化療。

1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑 兔抗人RhoA多克隆抗體，鼠抗人CD34單克隆抗體、鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶（SP）免疫組化染色試劑盒均購自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3方法 采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶（Streptavidin-peroxidease， SP）免疫組化技術(shù)。所有新鮮標(biāo)本均用10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，選擇典型病灶連續(xù)切片，片厚4 μm，做免疫組化染色。SP法檢測不同宮頸組織中RhoA和CD34的表達(dá)情況。以PBS代替一抗作為陰性對照，用公司提供的陽性切片作為陽性對照。

1.4陽性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

1.4.1 RhoA染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) RhoA免疫組織化學(xué)顯色為棕黃色顆粒，分布于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。評分標(biāo)準(zhǔn)按Martin-Villar[5]等的方法，根據(jù)染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞百分率進(jìn)行評分，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)典型腫瘤細(xì)胞視野（×400），每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞，各自計(jì)算100個(gè)腫瘤細(xì)胞中陽性細(xì)胞數(shù)量和著色強(qiáng)度分別記錄，取平均值。評分方法如下：①根據(jù)細(xì)胞著色強(qiáng)弱（記為a）計(jì)分：不著色（陰性）為0分，淺黃色（弱陽性）為1分，棕黃色（陽性）為2分，棕褐色（強(qiáng)陽性）為3分。②根據(jù)陽性細(xì)胞百分比（記為b）著色細(xì)胞百分率1%～25%為1分，25%～50%為2分，50%～75%為3分，75%～100%為4分。③a與b乘積為HIS評分，0分為（-），1～4分為（+），5～8分為（++），9～12分為（+++）。統(tǒng)計(jì)分析時(shí)（-）記為陰性，（+）-（+++）記為陽性。

1.4.2 MVD陽性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) MVD的測定方法：參照Weidner等[6]的方法：以血管內(nèi)皮細(xì)胞呈棕色或棕黃色為CD34陽性。切片在100倍光鏡下挑選微血管分布最高密度區(qū)域，在200倍光鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)不重復(fù)視野中被CD34染成棕黃的微血管數(shù)，取其平均值作為MVD。每個(gè)與鄰近微血管明顯分離的陽性染色的血管內(nèi)皮細(xì)胞或血管內(nèi)皮細(xì)胞簇都視為獨(dú)立的微血管；只要結(jié)構(gòu)不相連，其分支結(jié)構(gòu)也計(jì)作一個(gè)血管計(jì)數(shù)。直徑大于8個(gè)紅細(xì)胞直徑的血管，有厚的平滑肌的血管不在計(jì)數(shù)范圍內(nèi)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用t檢驗(yàn)、方差分析、秩和檢驗(yàn)及Spearman秩相關(guān)。取α=0.05（雙側(cè)）作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果用SPSS 13.0軟件分析。

2結(jié)果

2.1 RhoA蛋白在正常宮頸組織、宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸鱗癌中的表達(dá) RhoA蛋白表達(dá)主要定位于細(xì)胞胞漿，以胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。高分化鱗癌細(xì)胞中主要表達(dá)淡黃色顆粒，低分化鱗癌中主要表達(dá)棕黃色顆粒，隨分化程度降低顆粒顏色逐漸加深；CIN組RhoA蛋白在異型細(xì)胞胞漿的中表達(dá)為淡黃色顆粒；正常宮頸組上皮細(xì)胞胞漿中未見RhoA蛋白的陽性表達(dá)。見圖1、圖2、圖3。

圖3 RhoA在宮頸鱗癌中的陽性表達(dá)（×400倍）

3討論

RhoA是近年來研究較多的一類轉(zhuǎn)移促進(jìn)基因，RhoA蛋白是Rho蛋白家族中的重要成員之一，其主要作用有：增加肌動-肌球蛋白的收縮力，調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架，促使腫瘤細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)中遷移[7]；通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)細(xì)胞周期素D1的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖；降低細(xì)胞間粘附作用，為細(xì)胞的遷移提供可能；促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞局部浸潤；促進(jìn)腫瘤血管的生成，協(xié)助腫瘤細(xì)胞穿越血管內(nèi)皮細(xì)胞向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等[8]。同時(shí)，在腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移中，微血管增生是必不可少的條件之一。血管內(nèi)皮細(xì)胞增生、黏附并與細(xì)胞外基質(zhì)黏附形成新生微血管，為腫瘤細(xì)胞提供營養(yǎng)和轉(zhuǎn)移路徑[9-10]。微血管密度（MVD）是臨床上協(xié)助判斷腫瘤惡性程度和預(yù)后的重要的生物學(xué)指標(biāo)[11]，微血管密度增高與腫瘤的進(jìn)展、預(yù)后不良有密切關(guān)系[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 RhoA蛋白在正常宮頸組織中無表達(dá)，在CIN和宮頸鱗癌組織中的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，并且隨著宮頸鱗癌分化程度的降低，RhoA的陽性表達(dá)率逐漸增高，提示RhoA在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中可能起發(fā)揮促進(jìn)作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)正常宮頸組織血管分布規(guī)則、均勻，微血管血管少。癌組織內(nèi)血管分布不均，微血管形態(tài)異常，管腔大小不一，基底膜不完整，彌漫分布于癌組織間，說明血管密度增大能為癌腫提供更多的營養(yǎng)支持，促進(jìn)腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)RhoA的表達(dá)與宮頸鱗癌組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、患者年齡、臨床分期有關(guān)，雖然淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和組織學(xué)分級沒有納入宮頸癌的臨床分期，但普遍被婦科腫瘤學(xué)者承認(rèn)的是組織學(xué)分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響宮頸癌預(yù)后的重要因素[13]。Jiang[14]等研究發(fā)現(xiàn)RhoA的表達(dá)水平與乳腺癌的病理組織分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)；于月成[15]等發(fā)現(xiàn)在上皮性卵巢癌及有轉(zhuǎn)移的淋巴組織中RhoA高表達(dá)，且RhoA的陽性表達(dá)與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移和短生存期相關(guān)；顧穎[16]等研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌中RhoA的陽性表達(dá)與組織學(xué)分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。實(shí)驗(yàn)同時(shí)顯示隨著臨床分期增加、惡性程度增高，MVD值逐漸增多并表現(xiàn)出明顯差異。推測隨宮頸鱗癌惡性程度增高，在RhoA和其他某些因素作用下，血管內(nèi)皮細(xì)胞增生形成新生血管，為腫瘤細(xì)胞提供更多的營養(yǎng)支持和轉(zhuǎn)移路徑，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。

本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，在從正常宮頸組織到宮頸浸潤癌的發(fā)生發(fā)展中，RhoA和MVD成上調(diào)趨勢，RhoA表達(dá)水平的上調(diào)使腫瘤細(xì)胞降解基底膜及細(xì)胞外基質(zhì)，在侵襲、轉(zhuǎn)移過程中突破各種屏障如子宮頸上皮細(xì)胞的基底膜、血管基底膜和淋巴管基底膜的能力增強(qiáng)，同時(shí)，MVD增多使腫瘤細(xì)胞獲得更多的營養(yǎng)，促進(jìn)腫瘤的生長，有利于轉(zhuǎn)移發(fā)生。

由上可見，RhoA可能通過破壞腫瘤細(xì)胞間的粘附作用，降解細(xì)胞外基質(zhì)，加快腫瘤新生血管的生成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。我們可以通過干擾RhoA的表達(dá)，影響腫瘤的生物學(xué)特性，包括影響細(xì)胞的增殖、分化、粘附、浸潤等多個(gè)環(huán)節(jié)，從而增加對宮頸鱗癌患者的治療效果和改善預(yù)后。

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編輯/肖慧