五分類血液分析儀技術(shù)原理與展望

隨著電子技術(shù)、流式細(xì)胞技術(shù)、激光技術(shù)、電子計(jì)算機(jī)技術(shù)和新熒光化學(xué)物質(zhì)等各種高新技術(shù)在血細(xì)胞分析儀中的應(yīng)用使血細(xì)胞分析儀的檢測(cè)原理不斷完善、測(cè)量參數(shù)不斷增加、檢測(cè)水平不斷提高尤其在白細(xì)胞五分類技術(shù)方面，已發(fā)展到利用多項(xiàng)技術(shù)（如射頻、細(xì)胞化學(xué)染色、流式細(xì)胞術(shù)和熒光染色技術(shù)等）聯(lián)合同時(shí)檢測(cè)一個(gè)白細(xì)胞再用先進(jìn)的計(jì)算機(jī)技術(shù)區(qū)分、辨別經(jīng)上述方法處理后的各自細(xì)胞間的細(xì)胞差別綜合分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，得出較為準(zhǔn)確的白細(xì)胞分類結(jié)果。為臨床疾病的診斷、治療提供了重要的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。近年來，可以對(duì)白細(xì)胞進(jìn)行五分類計(jì)數(shù)的血細(xì)胞分析儀已經(jīng)普遍使用。本文就目前血細(xì)胞五分類測(cè)定中常用技術(shù)及其最新應(yīng)用進(jìn)展作一綜述。

1血細(xì)胞五分類技術(shù)的原理

1.1流式細(xì)胞術(shù)[1] 流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）是一種綜合應(yīng)用光學(xué)、機(jī)械學(xué)、流體力學(xué)、電子計(jì)算機(jī)、細(xì)胞生物學(xué)、分子免疫學(xué)等學(xué)科技術(shù)，使被測(cè)溶液流經(jīng)測(cè)量區(qū)域，并逐一檢測(cè)其中每一個(gè)細(xì)胞的物理和化學(xué)特性，從而對(duì)高速流動(dòng)的細(xì)胞或亞細(xì)胞進(jìn)行快速定量測(cè)定和分析的方法。

首先，待測(cè)細(xì)胞經(jīng)處理或染色后被壓人流動(dòng)室，與此同時(shí)，不含細(xì)胞的緩沖液在高壓下從鞘液管噴出，鞘液管人口方向與待測(cè)樣品流成一定角度，這樣鞘液就能被包繞著樣品高速流動(dòng)，組成一個(gè)圓形的流束，待測(cè)細(xì)胞在包繞下單行排列，依次通過檢測(cè)區(qū)域在激光束的照射下產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光。這兩個(gè)光源信號(hào)分別反映了細(xì)胞體積的大小和內(nèi)部的信息經(jīng)光電倍增管接收后可轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，再通過模，數(shù)轉(zhuǎn)換器將連續(xù)的電信號(hào)轉(zhuǎn)換為可被計(jì)算機(jī)識(shí)別的數(shù)字信號(hào)，經(jīng)計(jì)算機(jī)處理，可將分析結(jié)果顯示在屏幕上。

為了保證細(xì)胞單個(gè)排列地逐一通過檢測(cè)區(qū)域，鞘流技術(shù)在流式細(xì)胞術(shù)中被廣泛應(yīng)用。根據(jù)層流理論，由于兩種液體的流速和壓力不同。在一定條件下樣品溶液與包裹它的鞘液在流動(dòng)中可以保持相互分離并且同軸。同時(shí)鞘液流可以加速樣品溶液中顆粒的流動(dòng)并迫使他們的流動(dòng)軌跡保持在液流的中軸線上，使細(xì)胞單排列地逐一通過檢測(cè)區(qū)域，這便是所謂的液流聚焦原理

1.2阻抗法 根據(jù)庫爾特原理，將不良導(dǎo)體血液按一定比例稀釋于等滲的電解液中，在小孔電極的兩側(cè)加一恒流源在負(fù)壓作用下，使稀釋的血細(xì)胞通過小孔。當(dāng)細(xì)胞通過截面時(shí)會(huì)由于電阻增大產(chǎn)生相應(yīng)的脈沖，其脈沖的幅度與細(xì)胞的體積成正比，脈沖的頻度與細(xì)胞的數(shù)量成正比。這便是著名的庫爾特原理或稱變阻脈沖原理。利用庫爾特原理可以有效地區(qū)分淋巴及單核細(xì)胞。

1.3激光散射法/多角度偏振光散射技術(shù)[2] 根據(jù)光散射理論，當(dāng)激光照射到流動(dòng)室內(nèi)流過的每一個(gè)細(xì)胞時(shí)，由于細(xì)胞的物理特性，部分光線從細(xì)胞上經(jīng)不同的角度散射。其中，前向小角度散射光的光強(qiáng)可以反應(yīng)細(xì)胞體積；大角度散射光的光強(qiáng)可以反應(yīng)細(xì)胞核，漿復(fù)雜度和細(xì)胞顆粒的信息；而側(cè)向散射光的光強(qiáng)可以反應(yīng)細(xì)胞膜、核膜、細(xì)胞質(zhì)的變化。因此，可以依據(jù)細(xì)胞表明光散射的特點(diǎn)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分類。用激光光源產(chǎn)生的單色光束直接進(jìn)入計(jì)數(shù)池的敏感區(qū)，在不同角度（10°～70°）對(duì)每個(gè)細(xì)胞進(jìn)行掃描分析，測(cè)定其散射光強(qiáng)度，從而提供細(xì)胞結(jié)構(gòu)、形態(tài)的光散射信息。由于粗顆粒細(xì)胞的散射強(qiáng)度比細(xì)顆粒細(xì)胞更強(qiáng)，故光散射對(duì)細(xì)胞顆粒的構(gòu)型和顆粒質(zhì)量具有很好的區(qū)別能力。

多角度偏振散射技術(shù)用偏振激光束射照單個(gè)排列細(xì)胞，并進(jìn)一步分辨細(xì)胞。該技術(shù)采用了10°窄角和偏振加消偏振檢測(cè)法，分辨能力有所提高。它首先測(cè)試中性，單核細(xì)胞，用0°～90°的散射數(shù)據(jù)，再測(cè)得90°D的衍射差，將嗜酸性和中性細(xì)胞分開而嗜堿性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞則按其大小和內(nèi)部結(jié)構(gòu)不同的復(fù)雜性，所產(chǎn)生的散射光也各異，用可調(diào)較的門限加以區(qū)分。其采用特定程序自動(dòng)儲(chǔ)存分析數(shù)據(jù)，并經(jīng)計(jì)算機(jī)軟件處理，在屏幕上顯示6個(gè)散點(diǎn)圖和2個(gè)直方圖。

1.4各種細(xì)胞化學(xué)特性應(yīng)用技術(shù) 利用五種白細(xì)胞自身不同的化學(xué)性質(zhì)應(yīng)用相應(yīng)的化學(xué)試劑加以區(qū)分由于嗜酸性（或嗜堿性）粒細(xì)胞均有較強(qiáng)的堿性（或酸性），因此在特殊的溶血?jiǎng)┳饔孟?，?jīng)過特定時(shí)間及溫度的孵育，可使除嗜酸性（嗜堿性）粒細(xì)胞之外的所有細(xì)胞溶解或萎縮經(jīng)處理之后的細(xì)胞根據(jù)阻抗脈沖計(jì)數(shù)法，可得相應(yīng)嗜酸性（嗜堿性）細(xì)胞有效數(shù)值。

利用五種白細(xì)胞過氧化物酶活性的差異對(duì)白細(xì)胞進(jìn)行染色，測(cè)定其酶反應(yīng)強(qiáng)度，對(duì)白細(xì)胞進(jìn)行分析。血液中五種白細(xì)胞的過氧化物酶活性排列順序?yàn)椋菏人嵝粤＜?xì)胞>中性粒細(xì)胞>單核細(xì)胞。淋巴細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞均無過氧化物酶。將待測(cè)血液加入清洗劑和甲醛的等滲液體內(nèi)經(jīng)孵育，再加入過氧化氫和四氯一萘酚，細(xì)胞內(nèi)過氧化酶分解產(chǎn)生氧離子，使四氯一萘酚顯色并沉淀，并定位于酶反應(yīng)部位。根據(jù)酶反應(yīng)強(qiáng)度的不同，利用光電檢測(cè)技術(shù)測(cè)定相應(yīng)吸光度值的方法，用以區(qū)分嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞。

1.5電導(dǎo)，射頻法 與早期的三分類血液分析儀利用庫爾特原理不同的是，它在內(nèi)外電極上加了一個(gè)RF射頻發(fā)生器。RF是射頻電流的簡稱它是一種高頻交流變化電磁波。按照工作頻率的不同，RF可以分為低頻（LF）、高頻（HF）、超高頻（UHF）和微波等不同種類不同頻段的RF工作原理不同， 和HF頻段一般采用電磁耦合原理，而UHF及微波頻段的RF一般采用電磁反射原理。在血液分析儀中多采用高頻電磁波，其原理是交變電流通過導(dǎo)體時(shí)，會(huì)在導(dǎo)體周圍形成交變電磁場(chǎng)，形成電磁波。因?qū)w的密度及導(dǎo)電性質(zhì)等差異，其周圍所形成的電磁場(chǎng)也不相同。因此當(dāng)射頻電流穿透細(xì)胞膜透入胞內(nèi)時(shí)，由于核的大小、化學(xué)組分、顆粒多少以及漿核比例的不同，使RF信號(hào)發(fā)生不同的變化。借此可以將體積大小相同但內(nèi)部結(jié)構(gòu)不同的細(xì)胞區(qū)分開來，如淋巴細(xì)胞與嗜堿性細(xì)胞。

1.6熒光法 利用不同細(xì)胞的細(xì)胞膜、胞內(nèi)因子以及胞內(nèi)DNA、RNA、胞內(nèi)離子鈣等不同染色特性，選用具有特異性抗原或抗體的熒光染料載體，使待分離的細(xì)胞分別標(biāo)記相應(yīng)的熒光物質(zhì)，經(jīng)過特定波長的激光照射激發(fā)出不同波長的熒光，利用各種PMT管檢測(cè)熒光信號(hào)的個(gè)數(shù)，可以完成待檢細(xì)胞的計(jì)數(shù) 如進(jìn)一步分析計(jì)數(shù)淋巴細(xì)胞或網(wǎng)織紅細(xì)胞等

2血細(xì)胞五分類技術(shù)的現(xiàn)狀及展望

2.1五分類血液分析儀的現(xiàn)狀 全自動(dòng)五分類血細(xì)胞分析儀是多學(xué)科相互交叉、滲透、綜合的產(chǎn)物，涉及技術(shù)領(lǐng)域包括電子技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)、傳感器技術(shù)、信號(hào)處理技術(shù)、生物化學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、精密機(jī)械、光學(xué)、自動(dòng)控制、流體力學(xué)等領(lǐng)域。絕大多數(shù)\"五分類\"分析儀采用了流式細(xì)胞分析方法，而聯(lián)合檢測(cè)法則代表了五分類血細(xì)胞分析儀的最新發(fā)展趨勢(shì)。

由于不同儀器的檢測(cè)原理及相關(guān)試劑的差異，各類設(shè)備均有其相應(yīng)的特點(diǎn)?？傮w來講，光學(xué)檢測(cè)法結(jié)合特種化學(xué)試劑如染色物質(zhì)等由于其針對(duì)某一被檢物質(zhì)的特異性，因此其測(cè)定及分析結(jié)果較電阻法精確度要高，但相應(yīng)的試劑成本加大，同時(shí)對(duì)操作人員及環(huán)境的要求也會(huì)有所提高。

2.2五分類血液分析儀的展望 從五分類血液分析儀的發(fā)展進(jìn)程可以看出，臨床對(duì)血細(xì)胞的分析已不滿足于簡單的對(duì)WBC、RBC、PLT的計(jì)數(shù)，而是更傾向?qū)τ谄涓黝惣?xì)胞及其亞群的進(jìn)一步分析，包括從細(xì)胞內(nèi)部的DNA，RNA及免疫等方面進(jìn)行分析。因此，血細(xì)胞分析儀已從對(duì)細(xì)胞的簡單的物理性能的研究轉(zhuǎn)向?qū)?xì)胞內(nèi)部化學(xué)性質(zhì)及免疫性質(zhì)的研究方向發(fā)展，即從細(xì)胞學(xué)向分子生物學(xué)，從分子生物學(xué)向免疫學(xué)方向發(fā)展。同時(shí)，隨著工業(yè)科技的進(jìn)步，儀器的精度、速度、集成化、一體化的程度會(huì)更高，相信在不久的將來會(huì)有更先進(jìn)的血液分析系統(tǒng)面世。

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