熒光定量PCR技術(shù)在肺炎鏈球菌檢測中的應(yīng)用

摘要：目的 通過熒光定量PCR技術(shù)對痰中肺炎鏈球菌（SP）的檢測，明確其較傳統(tǒng)檢測方法的優(yōu)越性。方法 收集2013年1月～2014年1月入住我院呼吸科的123例AECOPD患者，對合格痰標(biāo)本（108例）進(jìn)行培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)結(jié)果；通過熒光RT-PCR技術(shù)檢測痰標(biāo)本中的SP，并粗略估算SP的感染率。結(jié)果 合格痰標(biāo)本108份，SP培養(yǎng)陽性率6.5%；而應(yīng)用熒光PCR定量檢測，陽性率為58.3%，粗略估計(jì)AECOPD中SP的感染情況，約為17.6%。結(jié)論 熒光定量PCR對細(xì)菌的檢測明顯優(yōu)于傳統(tǒng)培養(yǎng)方法。

關(guān)鍵詞：肺炎鏈球菌；COPD急性加重期；熒光定量PCR；痰細(xì)菌培養(yǎng)

1 資料與方法

1.1一般資料 收集我院123例臨床確診的AECOPD患者，入院時(shí)間為2013年1月～2014年1月，其中男性78例，女性45例，年齡46～87歲，既往有吸煙史者54人。全部病例符合中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)會慢性阻塞性肺疾病診治指南（2007年及2013年修訂版）的診斷標(biāo)準(zhǔn)[1，2]，患者主要表現(xiàn)有氣促加重，常伴有喘息、胸悶、咳嗽加劇、痰量增加、痰液顏色和（或）黏度改變、發(fā)熱及全身癥狀等，入院患者均具有CT，排除其他病變?nèi)绶伟?、單純肺炎、肺結(jié)核、肺間質(zhì)病等，10例患者合并支氣管擴(kuò)張，入院前應(yīng)用抗生素者22例。為減少抽樣誤差并排除季節(jié)及環(huán)境因素的影響，研究時(shí)間>1年。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑 基因擴(kuò)增儀（型號為Roche Light Cycler480），全自動細(xì)菌鑒定藥敏分析儀（美國碧迪）。引物、探針、標(biāo)準(zhǔn)品（大連寶生物工程有限公司合成）；肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，型號為BZW23112； 柱式小量細(xì)菌基因組 DNA 抽提試劑盒[3] （W6511）（上海華舜生物技術(shù)有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 痰標(biāo)本的收集 留取患者入院后次日清晨的合格痰標(biāo)本。合格標(biāo)本的判定標(biāo)準(zhǔn)（顯微鏡下）：鱗狀上皮細(xì)胞<10個(gè)/低倍視野 、中性粒細(xì)胞>25個(gè)/低倍視野，或兩者比例<1：2.5。對上述標(biāo)本進(jìn)行革蘭氏染色，對細(xì)菌數(shù)量、形狀進(jìn)行記錄。留取部分標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)，余收集在標(biāo)準(zhǔn)為1.5ml的EP管中，于-80℃冰箱中凍存。

1.3.2 痰培養(yǎng)過程 合格痰液標(biāo)本2h內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)操作。清洗后標(biāo)本轉(zhuǎn)移至無菌管中，加入消化液至標(biāo)本體積的2倍，充分顛倒混勻，靜置30min，然后按衛(wèi)生部微生物操作規(guī)程，三區(qū)劃線將標(biāo)本分別接種于血、伊紅美藍(lán)及巧克力瓊脂平板上，置于35℃、5%二氧化碳孵箱中過夜培養(yǎng)，18～24h觀察培養(yǎng)情況，對優(yōu)勢生長的細(xì)菌進(jìn)行分離并進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，于48h回報(bào)培養(yǎng)及藥敏結(jié)果。

1.3.3 熒光定量PCR過程

1.3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品的設(shè)計(jì) 將SP純菌液濃度稀釋為107、106、105、104、103 5個(gè)梯度，作為對比（單位為cfu/ml）。用標(biāo)準(zhǔn)菌株BZW23112提取出的DNA制作標(biāo)準(zhǔn)品：構(gòu)建線性化質(zhì)粒，

1.3.3.2 引物及熒光探針的設(shè)計(jì) 選取SP的特異性擴(kuò)增引物自溶素基因（lytA），探針標(biāo)記FMA熒光基團(tuán)。應(yīng)用Primer Express 軟件分析標(biāo)準(zhǔn)菌株的基因序列，在保守區(qū)域篩選引物，并在該引物的擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)設(shè)計(jì)一條特異性熒光探針，按照反應(yīng)體系的條件分別加入引物、探針、標(biāo)準(zhǔn)品及待測DNA，采用兩步法PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序，預(yù)變性：95 oC 30秒 1 Cycle，兩步法PCR：95 oC 5秒 60 oC 20秒40 Cycle。

1.3.3.3 標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線 見圖1，圖2。

1.3.3.4 檢測標(biāo)準(zhǔn) 空白對照管及未測出SP的管內(nèi)CT值為空；標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合度絕對值應(yīng)大于或等于0.98；樣本檢測無數(shù)值時(shí)為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，依實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)特點(diǎn)選擇適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)方法，采用平均數(shù)、Fisher's檢驗(yàn)等統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 痰培養(yǎng)檢測結(jié)果 123例AECOPD患者中，留取合格痰標(biāo)本數(shù)為108份，其痰培養(yǎng)結(jié)果為：銅綠假單胞菌，占8.3%，肺炎鏈球菌為7例，占6.5%，其余分別為白色念珠菌，占4.6%，肺炎克雷伯桿菌，占2.8%，陰溝腸桿菌，占1.9%，大腸埃希菌，占1.9%，奇異變形菌及熒光假單胞菌，均約占0.9%。

2.3 SP的感染情況 依半定量培養(yǎng)結(jié)果，在SP的菌落數(shù)≥105cfu/ml時(shí)，考慮其為感染性致病菌，而小于105cfu/ml時(shí)則認(rèn)為SP為非主要致病菌或?yàn)槲廴揪?。至今對拷貝?shù)確定是否為感染，尚無明確報(bào)道，但根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品與純菌液對比相關(guān)實(shí)驗(yàn)可以近似推斷，PCR結(jié)果在大于等于104時(shí)，考慮為致病菌感染；感染SP的例數(shù)為19例，所占比例為17.6%。

2.4 相關(guān)因素的影響 入院前應(yīng)用抗生素者為22例，去掉標(biāo)本不合格的患者數(shù)2例，對感染SP與未感染SP患者應(yīng)用抗生素情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果示：P值>0.05，結(jié)果顯示兩者無顯著性差異。既往有吸煙史患者54例，去掉標(biāo)本不合格患者數(shù)5例，對SP感染患者及非SP感染患者與吸煙因素進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示P>0.05，亦無顯著性差異。

3討論

做為成人下呼吸道最常見、最主要的病原菌，肺炎鏈球菌的致病性之強(qiáng)、危害性之大已成為了全球亟待關(guān)注的問題之一；因此，及早發(fā)現(xiàn)、及時(shí)治療尤為重要；對于SP的檢測方法種類較多，如痰液的細(xì)菌培養(yǎng)、Optochin敏感試驗(yàn)、菊糖發(fā)酵試驗(yàn)、膽汁溶菌試驗(yàn)、免疫層析法等，但臨床仍以痰培養(yǎng)做為主要檢測方式；該方式對于培養(yǎng)的條件、檢測時(shí)間的掌握均很苛刻；且培養(yǎng)耗時(shí)長，結(jié)果滯后，易導(dǎo)致病情的延誤；對此，研究者們努力致力于新式檢測方法的開發(fā)，熒光定量PCR技術(shù)便是其中一種，該方法不僅靈敏度高、特異性強(qiáng)，同時(shí)耗時(shí)更短，且克服了傳統(tǒng)PCR易污染、不能定量等缺陷，為疾病的基因?qū)W診斷開拓了更為廣闊的前景。

近年來，應(yīng)用RT-PCR檢測病原菌的相關(guān)報(bào)道已逐漸增多，如結(jié)核分支桿菌的檢測已開始應(yīng)用于臨床；Davinder等曾初步對COPD患者的痰液進(jìn)行熒光定量PCR檢測，驗(yàn)證了RT-PCR在臨床應(yīng)用上的重要作用；為進(jìn)一步探索RT-PCR在單菌種中的應(yīng)用價(jià)值，本實(shí)驗(yàn)在痰細(xì)菌培養(yǎng)方法檢測AECOPD中SP的基礎(chǔ)上，通過熒光定量PCR技術(shù)，比較兩種技術(shù)檢測SP所得結(jié)果陽性率的差別，并進(jìn)一步推斷AECOPD中SP的感染情況，探索RT-PCR技術(shù)更為廣泛的臨床價(jià)值。

細(xì)菌感染是引起AECOPD最常見的原因，研究者多數(shù)仍以痰細(xì)菌培養(yǎng)的方式對致病菌進(jìn)行確定，但所得結(jié)論差別較大。西方國家學(xué)者經(jīng)研究，普遍觀點(diǎn)認(rèn)為AECOPD的致病菌前三位為流感嗜血桿菌，肺炎鏈球菌，卡他莫拉菌；而我國的研究結(jié)果卻無明顯共性；此次，本實(shí)驗(yàn)共收集123例AECOPD患者，對其中合格痰標(biāo)本108例進(jìn)行培養(yǎng)，依據(jù)培養(yǎng)的規(guī)范化流程進(jìn)行痰液細(xì)菌培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SP培養(yǎng)的陽性率僅為6.5%。

RT-PCR做為一項(xiàng)較為熱門的分子學(xué)研究方法，為實(shí)驗(yàn)室與臨床構(gòu)建了重要的橋梁；Samuel Yang等首次應(yīng)用RT-PCR技術(shù)對成年人SP肺炎的痰標(biāo)本進(jìn)行了前瞻性研究，證明了該方法以痰液為檢測樣本，比普通痰培養(yǎng)方法更敏感性，也更節(jié)省時(shí)間；RT-PCR對咽拭子的檢測也有報(bào)道，Herein等對比了RT-PCR及半定量培養(yǎng)兩種方法，檢測鼻咽分泌物中SP的含量，得出RT-PCR的敏感性達(dá)到了100%，特異性96%。本實(shí)驗(yàn)主要對AECOPD患者中SP的感染進(jìn)行研究。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)過程中，選取自溶酶（lytA）做為特異性基因，制備引物、探針及標(biāo)準(zhǔn)品；實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用RT-PCR對細(xì)菌進(jìn)行研究，多采用的單位為拷貝數(shù)，即在細(xì)菌細(xì)胞中，某種特定質(zhì)粒的數(shù)目；以拷貝數(shù)計(jì)量，可以精確到所檢測細(xì)菌的個(gè)數(shù)；而臨床上應(yīng)用RT-PCR，多采用菌落數(shù)，即CFU（Colony-Forming Units），菌落中所繁殖的細(xì)菌個(gè)數(shù)不固定，拷貝數(shù)與菌落數(shù)的換算可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品與純菌對比進(jìn)行轉(zhuǎn)換獲得；檢測標(biāo)本數(shù)為108例，其中PCR陽性結(jié)果為63例，檢測范圍在1.598×101 -3.126×106，陽性率占58.3%，明顯高于痰細(xì)菌培養(yǎng)（6.5%），顯示了RT-PCR在單菌種特別是難培養(yǎng)菌種如SP檢測中的優(yōu)勢。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品與純菌液對比相關(guān)實(shí)驗(yàn)我們又可以近似推斷，感染SP的例數(shù)為19例，所占比例為17.6%。

患者多在入院前自行口服或靜點(diǎn)抗生素，抗生素濫用現(xiàn)象嚴(yán)重，極易造成耐藥菌的生長，給臨床治療及藥物選擇帶來困難。對此，我們統(tǒng)計(jì)了所收集患者入院前用藥情況，應(yīng)用相關(guān)抗生素者為22例，去掉標(biāo)本不合格的患者數(shù)2例，根據(jù)感染與未感染SP分組，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果提示：P值>0.05，結(jié)果顯示兩者無顯著性差異。由此可以推測，相關(guān)抗生素的應(yīng)用在感染SP的AECOPD患者中作用不明確。推測其結(jié)果，不除外機(jī)體的自身免疫參與病原體清除，也可能是患者未規(guī)范應(yīng)用藥物或藥物未覆蓋SP，導(dǎo)致病情延誤甚至加重。

對臨床相關(guān)影響因素的研究，選擇有無吸煙史作為一項(xiàng)研究因素，結(jié)果顯示P>0.05，無顯著性差異。由此判斷，吸煙做為COPD的一項(xiàng)誘因，與SP在AECOPD中的感染無直接關(guān)系。

應(yīng)用本方法，極少量的SP也能夠被檢出，故分析其是否為致病菌尤為重要：做為口咽部的正常菌群，檢測出SP，并不能直接判定感染，需要數(shù)量上的數(shù)據(jù)支持；而且，SP也是部分穩(wěn)定期COPD下呼吸道存在的定植菌；因此，即使檢測出患者痰中的SP，也可能說明此為引起AECOPD的原因。我們曾嘗試留取穩(wěn)定期COPD患者的痰液標(biāo)本，但穩(wěn)定期患者多數(shù)無痰或痰量很少，留取標(biāo)本多不合格，無法進(jìn)行培養(yǎng)或DNA的提取，故本實(shí)驗(yàn)未對穩(wěn)定期患者進(jìn)行研究。綜上，SP檢測的方法學(xué)各具特點(diǎn)，以此為基礎(chǔ)，我們?nèi)詰?yīng)當(dāng)結(jié)合患者的癥狀及其他檢查來明確病因，以避免因錯(cuò)誤判斷而錯(cuò)過最好的治療時(shí)機(jī)。

參考文獻(xiàn)：

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