無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測在4168例產(chǎn)前篩查高風(fēng)險(xiǎn)孕婦中的應(yīng)用

摘要：目的 評估無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測（noninvasive prenatal testing，NIPT）在胎兒染色體非整倍體篩查與診斷中的應(yīng)用價(jià)值。方法 2012年8月～2014年2月在湖南省婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心就診的孕早期或中期生化篩查高風(fēng)險(xiǎn)（21-三體風(fēng)險(xiǎn)≥1/270，18-三體風(fēng)險(xiǎn)≥1/350）的4168例孕婦，對其進(jìn)行NIPT，檢測結(jié)果為高風(fēng)險(xiǎn)者進(jìn)行傳統(tǒng)的胎兒核型分析確認(rèn)，檢測結(jié)果為低風(fēng)險(xiǎn)者隨訪妊娠結(jié)局。結(jié)果 4168例孕婦中，NIPT高風(fēng)險(xiǎn)59例，有52例做了傳統(tǒng)的胎兒核型分析，21-三體和18-三體符合率100%（32/32），13-三體符合率0（0/1），性染色體異常符合率31.58%（6/19）。4109例低風(fēng)險(xiǎn)孕婦隨訪到4000例，其中B超檢查發(fā)現(xiàn)胎兒結(jié)構(gòu)異常13例，引產(chǎn)12例。未發(fā)現(xiàn)21或18-三體出生。結(jié)論 NIPT對21-三體和18-三體檢測具有較高的敏感性和特異性；作為二線篩查方法用于妊娠早期或妊娠中期篩查陽性病例，可減少98%由于篩查假陽性而造成的不必要的侵入性產(chǎn)前診斷操作。

關(guān)鍵詞：無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測；產(chǎn)前篩查；高風(fēng)險(xiǎn)；染色體非整倍體；侵入性產(chǎn)前診斷

我國的出生缺陷總發(fā)生率約為5.6%[1]，出生缺陷人口的歷年遞增嚴(yán)重影響我國人口的整體素質(zhì)，不僅給家庭和社會帶來沉重負(fù)擔(dān)，也成為重大的社會人口問題之一，成為我國一個嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題[2]。染色體病是導(dǎo)致嚴(yán)重出生缺陷的重要原因，發(fā)生率約為1/160[3]。染色體病無法根治，可通過產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷進(jìn)行預(yù)防。常規(guī)的生化檢查-核型診斷-臨床引產(chǎn)流程存在耗時(shí)長、有創(chuàng)操作等缺陷[4]。易增加孕婦流產(chǎn)概率及心理負(fù)擔(dān)，同時(shí)由于唐氏篩查有較高的假陽性率，多數(shù)孕婦進(jìn)行產(chǎn)前羊水穿刺并非必要。目前廣泛開展的孕婦外周血中胎兒游離DNA大規(guī)模平行測序，檢測胎兒非整倍體無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測技術(shù)（noninvasive prenatal testing，NIPT）為當(dāng)前的產(chǎn)前篩查診斷模式提供了新的選擇。本研究針對高齡、唐氏生化篩查高風(fēng)險(xiǎn)孕婦，開展了NIPT檢測，現(xiàn)報(bào)告如下。

1資料與方法

1.1一般資料 2012年8月～2014年2月在湖南省婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心就診的孕早期或中期生化篩查高風(fēng)險(xiǎn)（21-三體風(fēng)險(xiǎn)≥1/270，18-三體風(fēng)險(xiǎn)≥1/350）的孕婦，對其進(jìn)行常規(guī)的侵入性產(chǎn)前診斷核型分析方法和胎兒非整倍體無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測技術(shù)介紹，經(jīng)過知情同意、自愿選擇接受無創(chuàng)產(chǎn)前DNA檢測，檢募集4168例。年齡18～46歲，孕12～35 w，B超提示單胎，自然妊娠，無地中海貧血基因攜帶者、孕前3個月無輸血或骨髓移植記錄。

1.2方法 孕婦外周血胎兒DNA的無創(chuàng)基因檢測與北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司合作，簽署知情同意書后，選取愿意參與試驗(yàn)的孕婦4168例，采用Streck管收集外周血10ml，通過兩次離心法從孕婦外周血中分享出血漿，使用商業(yè)化試劑盒提取血漿DNA，進(jìn)行文庫存制備，定量后進(jìn)行簇生成，在Hiseq 2000測序儀上完成36 bp高通量單端測序。數(shù)據(jù)分析時(shí)首先將測序結(jié)果序列與人類標(biāo)準(zhǔn)基因組（hg19）進(jìn)行比對，最后計(jì)算出待檢樣本的Z值，Z值=（待測樣本目標(biāo)染色體占全基因組的百分比-對照組正常組目標(biāo)染色體占全基因組百分比平均值）/對照正常組目標(biāo)染色體占全基因組百分比標(biāo)準(zhǔn)差）。

測序得出的原始序列落在每個染色體上的比值都處在一個固定的范圍內(nèi)（CV<1%，CV即變異系數(shù)=標(biāo)準(zhǔn)差/平均值），通過目標(biāo)染色體序列占全基因序列比值是否偏離正常樣本標(biāo)準(zhǔn)差便能判讀出胎兒目標(biāo)染色體是否為3條。

1.2細(xì)胞染色體核型分析 無創(chuàng)基因檢測高風(fēng)險(xiǎn)者，15～24 w者在B超引導(dǎo)下行羊膜腔穿刺術(shù)抽取羊水20～30 mL，>24 w者在B超引導(dǎo)下抽取臍血0.5～1 mL，進(jìn)行細(xì)胞染色體核型分析。

1.3對于無創(chuàng)基因檢測低風(fēng)險(xiǎn)者，部分患者于妊娠結(jié)束時(shí)抽取臍帶血，進(jìn)行細(xì)胞染色體核型分析，其余隨訪其胎兒出生后情況。

2結(jié)果

2.1無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測結(jié)果 檢測的4168例孕婦中，結(jié)果顯示為高風(fēng)險(xiǎn)共59例，陽性率為1.42%。其中21-三體高風(fēng)險(xiǎn)為33例，18-三體高風(fēng)險(xiǎn)5例，13-三體高風(fēng)險(xiǎn)1例，性染色體異常高風(fēng)險(xiǎn)20例。

2.2確診結(jié)果 以羊水或臍血染色體核型分析的結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果對照，檢測出的33例21-三體高風(fēng)險(xiǎn)確診29例為21-三體，另4例因未婚或無生育指標(biāo)等原因拒絕侵入性產(chǎn)前診斷，自行引產(chǎn)，無法確定核型；檢測出的5例18-三體高風(fēng)險(xiǎn)確診3例為18-三體，1例超聲發(fā)現(xiàn)多發(fā)畸形在外院引產(chǎn)和1例自然流產(chǎn)未確定核型；檢測出的1例13-三體高風(fēng)險(xiǎn)確診正常；檢測出的20例性染色體異常高風(fēng)險(xiǎn)確診6例性染色體異常，1例胎兒畸形，幾乎無羊水平段未確定核型，13例確診正常，見表1。

2.3 NIPT低風(fēng)險(xiǎn)孕婦妊娠結(jié)局隨訪結(jié)果 4109例低風(fēng)險(xiǎn)孕婦隨訪到4000例，其中B超檢查發(fā)現(xiàn)胎兒結(jié)構(gòu)異常13例（先天性心臟病6例、唇腭裂3例、肺囊性腺瘤樣病變1例、多囊性腎發(fā)育不良1例、足內(nèi)翻1例、左腎缺如1例），引產(chǎn)12例。已分娩嬰兒中未發(fā)現(xiàn)21或18-三體綜合征出生。

3討論

3.1 NIPT對胎兒染色體非整倍體檢測的臨床價(jià)值 胎兒染色體非整倍體的無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測（noninvasive prenatal testing，NIPT），是利用大規(guī)模平行測序技術(shù)（massively parallel sequencing，MPS）對母體外周血中的游離DNA進(jìn)行深度測序，獲取胎兒染色體信息的方法。1997年香港中文大學(xué)的盧煜明教授等通過PCR擴(kuò)增得到母體外周血中Y染色體的特異性DNA序列，從而證明懷有男性胎兒的母血漿中存在胎兒游離DNA（cell free fetal DNA，cffDNA）[5]。新一代測序技術(shù)的快速發(fā)展和成熟為cffDNA的檢測提供了技術(shù)保障，從孕5 w開始，孕婦外周血中即可檢測到胎兒的游離DNA，胎兒游離DNA含量隨孕周增大而增加。目前的研究顯示，NIPT對胎兒21-三體檢測敏感性和特異性較高，對其他染色體非整倍體的檢測目前也有了一些進(jìn)展[6]。

本研究結(jié)果顯示NIPT對21-三體和18-三體檢測的特異性和敏感性均為100%，陽性預(yù)測值100%。1例13-三體高風(fēng)險(xiǎn)染色體結(jié)果正常，20例性染色體異常高風(fēng)險(xiǎn)染色體結(jié)果正常的有13例，提示目前的分析策略對13-三體和性染色體數(shù)目異常的識別率尚不理想。Chen等[7]采用非重復(fù)掩蓋的人基因組參考序列提高測序短序列的比對匹配數(shù)量，并校正GC含量偏倚，這種新分析策略使13-三體識別率從36%提升到100%（25/25）。因此，分析技術(shù)的改進(jìn)，將進(jìn)一步提升對13-三體和其他染色體數(shù)目異常的識別能力，拓展NIPT的應(yīng)用范圍。本研究中4109例NIPT的低風(fēng)險(xiǎn)未發(fā)現(xiàn)21-三體假陰性，陰性預(yù)測值達(dá)到100%，但樣本量有限，存在2.65%的失訪率，還需更多檢測數(shù)據(jù)證實(shí)。

3.2 NIPT避免了一部分常規(guī)產(chǎn)前篩查假陽性孕婦不必要的侵入性產(chǎn)前診斷操作 為了減少染色體病患兒的出生，目前國內(nèi)推廣對廣大孕婦進(jìn)行孕早期和孕中期血清學(xué)篩查[8]，可以發(fā)現(xiàn)染色體異常高危人群；而對高危孕婦進(jìn)行羊膜腔穿刺等侵入性產(chǎn)前診斷技術(shù)行染色體核型分析是產(chǎn)前篩查后續(xù)重要的產(chǎn)前診斷方法，為臨床的金標(biāo)準(zhǔn)[9]，但有創(chuàng)取樣有0.5%～2%的流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)，且容易導(dǎo)致胎膜早破、絨毛羊膜炎、陰道出血、早產(chǎn)等并發(fā)癥，而且這種篩查技術(shù)本身存在5%以上的假陽性率的問題[10]，導(dǎo)致高危孕婦接受率偏低，即依從性差。傳統(tǒng)的有創(chuàng)產(chǎn)前診斷技術(shù)還存在診斷通量低下，專業(yè)人員缺乏，人員培訓(xùn)及實(shí)驗(yàn)室建設(shè)周期長，報(bào)告時(shí)限過長等諸多問題[10]。湖南省婦幼衛(wèi)生信息監(jiān)測顯示，2012年，湖南省孕產(chǎn)婦數(shù)852982人，共行產(chǎn)前篩查330467人，篩查率38.74%。篩查高危孕婦20553人，有9559人接受產(chǎn)前診斷，高危人群產(chǎn)前診斷率為46.51%，盡管篩查工作的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，但就目前的篩查量而言，后續(xù)的產(chǎn)前診斷的技術(shù)力量已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到要求。大量篩查陽性的病例缺乏后續(xù)診斷，失去篩查的意義。

本研究表明NIPT對21-三體和18-三體具有很高的敏感性，把NIPT作為二線篩查方法用于妊娠早期或妊娠中期篩查陽性病例，可減少98%由于篩查假陽性而造成的不必要的侵入性產(chǎn)前診斷操作，同時(shí)減少操作相關(guān)的不良后果，有效地緩解侵入性產(chǎn)前診斷技術(shù)力量不足的現(xiàn)狀。

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編輯/肖慧