加味宮外孕Ⅱ號方對早孕大鼠滋養(yǎng)細胞的影響

摘要：目的 探討中藥加味宮外孕Ⅱ號方對早孕大鼠滋養(yǎng)細胞的影響，進一步探索中藥的殺胚作用和作用機理。方法 將55只造模成功的早孕大鼠隨機分為6組：西藥組、中西藥結合組和中藥低、中、高劑量組、空白組，分別予以連續(xù)給藥7d（西藥組肌注甲氨蝶呤，中西藥結合組肌注甲氨蝶呤和加味宮外孕Ⅱ號方中劑量中藥灌胃，中藥低、中、高劑量組分別予加味宮外孕Ⅱ號方低、中、高劑量灌胃，空白組予生理鹽水灌胃），第8d處死大鼠，取出子宮及孕囊行光鏡及電鏡檢測。結果 用藥后各組與空白組比較，滋養(yǎng)細胞組織形態(tài)及超微結構均有不同程度的病理學改變，中藥低、中劑量組及西藥組滋養(yǎng)細胞排列紊亂，有炎性細胞浸潤，胚囊正常形態(tài)被破壞，線粒體腫脹；高劑量組及結合組滋養(yǎng)細胞及胚囊正常形態(tài)完全消失，無或少量壞死組織殘留，線粒體出現空泡化。結論 加味宮外孕Ⅱ號方可能通過改變滋養(yǎng)細胞的組織形態(tài)及超微結構，影響滋養(yǎng)細胞的數量、形態(tài)、分泌、合成等生理代謝功能，從而起到殺胚作用，其中變化表現最明顯的是中藥高劑量組，說明隨著中藥濃度的增大，滋養(yǎng)細胞破壞更明顯。

關鍵詞：加味宮外孕Ⅱ號方；早孕大鼠；滋養(yǎng)細胞

目前在臨床上異位妊娠的保守治療主要以中西醫(yī)結合治療為主，西藥殺胚的機理明確，而關于活血消癥殺胚中藥的機理研究則很少見，其機理尚不明確。目前未找到有關異位妊娠動物模型的建立方法，由于異位妊娠早期與早期宮內妊娠相似，因此，我們以早孕大鼠作實驗模型，通過觀察加味宮外孕Ⅱ號方對早孕大鼠滋養(yǎng)細胞組織形態(tài)及超微結構的影響的實驗研究，進一步探索中藥的殺胚作用和作用機理，間接為中醫(yī)藥保守治療異位妊娠提供新的理論依據。

1資料與方法

1.1一般資料 SD 大鼠共110只，雄性30只，體重（280±10）g，雌性80只，體重（250±10）g，由重慶第三軍醫(yī)大學醫(yī)學實驗動物中心提供，實驗動物許可證號：SCXK（渝）2012-0005。

1.2儀器 OLMPUS光學顯微鏡，日立H-600型透射電鏡，包埋機，石蠟切片機，脫水機，攤片機，烤片機（美國LEICA）。

1.3藥物 加味宮外孕Ⅱ號方：丹參15 g，桃仁9 g，赤芍15 g，莪術9 g，三棱9 g，全蝎10 g，地鱉蟲10 g，蜈蚣9 g，紫草25 g，由貴陽中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院中藥制劑室通過水煎、過濾、濃縮制成每毫升含生藥6 g、3 g、1.5 g三種不同劑量（即：高劑量、中劑量、低劑量）的藥液；分裝密封，于4度冰箱保存?zhèn)溆?；甲氨喋? mg/支 （山西普德藥業(yè)有限公司生產）。

1.4方法

1.4.1動物造模 造模方法參照徐叔云《藥理實驗方法學》[1]：將動情期雌鼠共69只與雄鼠按1∶1比例合籠過夜，次晨將發(fā)現陰栓或行陰道涂片發(fā)現精子者定為妊娠的第 1 d。為避免假孕大鼠對實驗準確性產生影響，參照文獻[2]后本實驗在第5 d起連續(xù)對交配成功的大鼠行陰道脫落細胞檢查，共檢查3 d，剔除交配成功而未受孕的大鼠14只。

1.4.2分組及給藥 將造模成功的55只孕鼠隨機分為6組：西藥組、中西藥結合組和中藥低、中、高劑量組、空白組。西藥組在妊娠第1 d一次性肌注甲氨蝶呤7.775 mg/Kg體重，一次為一療程，同時予生理鹽水7.77 mL/Kg體重灌胃1次/d；中西藥結合組于妊娠第1 d起予加味宮外孕Ⅱ號方煎劑按7.77 mL/Kg體重（每毫升含生藥3 g）灌胃1次/d，同時在妊娠第1 d一次性肌注甲氨蝶呤7.775 mL/Kg體重；中藥高、中、低劑量組分別在妊娠第1 d予相應劑量的加味宮外孕Ⅱ號方煎劑按7.77 mL/Kg體重灌胃，1次/d，空白組予等量生理鹽水灌胃；各組均連續(xù)灌胃7 d。

1.4.3標本制備及檢測 用藥后第7日晚8點起禁食水，于12 h后處死大鼠，剖腹取出大鼠子宮及孕囊，平均分成兩份，一份浸入4%多聚甲醛液中固定24 h，再進行常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色，行光鏡下觀察。另一份切取1 mm2大小組織塊用2.5% 的戊二醛液固定，置于4℃冰箱內固定24 h，再按照電鏡常規(guī)標本制作，于透射電鏡下觀察滋養(yǎng)細胞的超微結構。

2結果

2.1光鏡檢測 空白組滋養(yǎng)細胞發(fā)育良好，細胞間隙緊密、排列整齊、體積大、扁平，胚囊完整；西藥組滋養(yǎng)細胞間隙不清、排列紊亂，大量炎性細胞浸潤，胚囊正常形態(tài)破壞；中西藥結合組滋養(yǎng)細胞及胚囊正常形態(tài)完全消失，無或少量壞死組織殘留；中藥中劑量組滋養(yǎng)細胞間隙增大、排列紊亂，炎性細胞浸潤，胚囊正常形態(tài)被破壞；低劑量組滋養(yǎng)細胞間隙增大、排列紊亂、少量炎性細胞浸潤，胚囊正常形態(tài)破壞；高劑量組滋養(yǎng)細胞及胚囊正常形態(tài)完全消失，大量炎癥細胞浸潤，無或少量壞死組織殘留，見圖1。

2.2電鏡檢測 空白組可見到清晰的核膜及核仁，均勻的染色質（常染色質）散布于核質內；西藥組細胞核呈橢圓形，異染色質邊集，線粒體腫脹；結合組細胞與細胞的間隙明顯增寬，細胞核的核漿致密，內含邊集，呈團塊狀的異染色質，線粒體出現空泡化；中藥中劑量組細胞核形狀不規(guī)則，異染色質增多，線粒體腫脹；低劑量組線粒體腫脹；高劑量組整個細胞腫脹，線粒體腫脹，脊斷裂或消失，見圖2。

3討論

異位妊娠（ectopic pregnancy ，EP）是婦產科的常見病，嚴重威脅育齡婦女生命安全并影響生殖功能，目前在臨床上異位妊娠的保守治療主要以中西醫(yī)結合治療為主。中醫(yī)學認為血瘀和氣虛導致胎元阻絡是本病的病因病機，主要證候是少腹血瘀之實證，以活血化瘀，消癥殺胚為治法，運用活血化瘀消癥中藥。本實驗所用加味宮外孕Ⅱ號方是在宮外孕Ⅱ號方的基礎上加蜈蚣、全蝎、土鱉蟲、紫草。方中丹參、赤芍、桃仁、三棱、莪術有活血化瘀、消徵散結的作用；蜈蚣、全蝎、土鱉蟲、紫草有破血、殺胚的作用。全方以活血化瘀，殺胚消徵為治法，改善胎元阻絡，氣血運行不暢現狀，達到殺胚消徵，通暢氣血經絡之功效。

滋養(yǎng)細胞（trophoblast cel1）是胎盤組織的主要功能細胞，在正常妊娠過程中具有類似腫瘤的浸潤能力，有利于母胎間的營養(yǎng)供給[3]。本實驗專注于對滋養(yǎng)細胞的組織形態(tài)學及超微結構研究，以此佐證加味宮外孕Ⅱ號方的殺胚作用。從實驗結果可以看出，應用西藥及殺胚中藥后滋養(yǎng)細胞的組織形態(tài)及超微結構較空白組均產生不同程度的影響，中藥低、中劑量組及西藥組滋養(yǎng)細胞排列紊亂，有炎性細胞浸潤，胚囊正常形態(tài)被破壞，線粒體腫脹；高劑量組及結合組滋養(yǎng)細胞及胚囊正常形態(tài)完全消失，無或少量壞死組織殘留，線粒體出現空泡化，不同劑量的加味宮外孕Ⅱ號方均能改變滋養(yǎng)細胞的超微結構，特別體現在線粒體上，因線粒體是能量代謝的場地，由此筆者推測加味宮外孕Ⅱ號方可能通過細胞內線粒體的結構破壞而使線粒體合成的ATP量變少，導致細胞功能障礙，并促使炎癥細胞浸潤，影響滋養(yǎng)細胞的正常生理代謝過程，促進細胞凋亡或壞死，不能為胚胎提供營養(yǎng)支持，從而起到殺胚作用。且隨著中藥濃度的增大，滋養(yǎng)細胞破壞更明顯，殺胚作用更強。但高劑量的中藥是否會加重藥物的副作用有待今后進一步深入研究，從而指導臨床用藥。

參考文獻：

[1]徐淑云，卞職濂，陳修，等.藥理實驗方法學[M].2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，1991：1313-1314.

[2]趙春梅，鄭文蘭.陰道脫落細胞檢查對確定大鼠妊娠價值的探討[J].內蒙古中醫(yī)藥，2013，32（2）：31-32.

[3]Harris LK，Review：trophoblast-cascular cell interactions in early pregnancy：how to remodel a vesse[J].Placenta，2010，31：93-98.

編輯/肖慧