世居不同高海拔藏族EGLN1多態(tài)與海拔水平的關(guān)聯(lián)研究

王博洋 ，巴桑卓瑪，李 蕾，央 拉，劉 蘭，崔超英，龔嘎蘭孜，尼瑪玉珍，多 吉，王笑峰，金 力

（1.復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 現(xiàn)代人類學(xué)教育部重點實驗室，上海 200438；2.復(fù)旦大學(xué) 遺傳工程國家重點實驗室，上海 200438；3.西藏大學(xué)醫(yī)學(xué)院，西藏自治區(qū) 拉薩 850002；4.西藏自治區(qū)人民醫(yī)院，西藏自治區(qū) 拉薩 850001；5.日喀則疾病預(yù)防控制中心，西藏自治區(qū) 日喀則 857000）

在高原環(huán)境中，氧氣濃度隨著海拔升高而逐漸降低，成為人類生存的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)［1－2］.高原適應(yīng)（High Altitude Adaptation）是指高原世居者為了在高原低氧環(huán)境中生存而產(chǎn)生的長期的、不可逆的、可遺傳的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理改變［3］.藏族人在青藏高原上已世代居住超過2.5萬年［4－5］，而長期居住使藏族人的表型適應(yīng)著高海拔低氧環(huán)境的自然選擇［6］.此外，藏族人與外族通婚少、遺傳背景均一［4，7］，成為了人類高原適應(yīng)研究最廣泛的人群.

既往研究顯示，同低海拔人群相比，世居藏族人群具有較高的肺通氣量和較低的血紅蛋白（Hemoglobin，Hb）濃度［8－10］.另有候選基因關(guān)聯(lián)研究顯示，遺傳因素與藏族人肺通氣量和動脈血氧飽和度（SaO2）等表型相關(guān)［11－12］.最近，包括我們在內(nèi)的全基因組研究在Egl－9家族同源物1（EGLN1）中發(fā)現(xiàn)世居藏族高原適應(yīng)的強(qiáng)烈正選擇信號［5－6，13－17］.同低海拔人群相比，藏族人群的EGLN1 單核苷酸多態(tài)（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）及構(gòu)成的單倍型頻率高度分化，提示在長期高原生存過程中，獲得高海拔低氧適應(yīng)的功能變異在藏族人中高度富集［6，17－18］.此外，全基因組研究還發(fā)現(xiàn)EGLN1多態(tài)與藏族人較低的Hb濃度存在關(guān)聯(lián)［17］.然而，極少有研究報道同樣生活在高海拔地區(qū)的同一個高原民族隨著居住海拔水平的升高，其遺傳是否有差異，某基因變異是否隨海拔升高進(jìn)一步被選擇［19－20］.

Moore等［21］比較了肌紅蛋白（Myoglobin，Mb）基因A79G 和T106C多態(tài)在世居于3 000m、3 700m和4 500m 的世居藏族人群和低海拔人群的分布，發(fā)現(xiàn)這3個藏族人群的Mb79A 頻率均高于低海拔人群.他們進(jìn)一步在世居于3 個不同水平高海拔的藏族人群中比較Mb79A 的頻率.雖然Mb79A 在3 000m、3 700m 與4 500m 海拔逐漸升高時分布無顯著差異［21］，但Moore等的研究方法提示了一個研究高原適應(yīng)機(jī)制的切入點，即在藏族人群中進(jìn)一步尋找不同的高海拔水平的遺傳差異.基于以上考慮，本研究選擇既往在高海拔同平原人群對比研究中多次報道的EGLN1 的4 個熱點SNPs rs2790882、rs480902、rs2486736和rs2739513［6，13，17］，探索它們及其構(gòu)成的單倍型在世居于2 700 m、3 700 m 和4 700m的3個世居藏族人群中的頻率是否有差異，并探索EGLN1多態(tài)與藏族人肺功能、SaO2等生理表型的關(guān)聯(lián).值得一提的是，在藏族人中這4個SNPs在EGLN1第一內(nèi)含子中構(gòu)成了一個長度為17.6kb的單倍域（r2位于0.994～0.999之間）.同時選擇此單倍域中的4個SNPs進(jìn)行研究，除了它們是高海拔同平原人群差異的熱點SNPs外，還為考察本研究結(jié)果的重復(fù)性及穩(wěn)定性提供參考.

1 對象與方法

1.1 研究對象

隨機(jī)選取602名16～26歲健康藏族個體，其中178名從西藏波密縣（海拔2 700m）、245名從西藏波密縣（海拔3 700m）、179名從西藏安多縣（海拔4 700m）募集.所有對象無血緣關(guān)系，無異族通婚史，在當(dāng)?shù)鼐幼≈辽偃陨?根據(jù)居住地的海拔，將研究對象分為低水平高海拔組（LHA），中水平高海拔組（MHA）和高水平高海拔組（HHA）.具體的人口學(xué)資料見表1.本研究獲得復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn)，18歲以上對象由本人、18歲以下對象由監(jiān)護(hù)人簽署書面知情同意書.

表1 世居藏族研究對象的人口學(xué)和表型特征Tab.1 Demographic and phenotypic characteristics of the studied Tibetan subjects

1.2 研究方法

1.2.1 指標(biāo)測量

測量體重（kg）和身高（m），并計算BMI.使用標(biāo)準(zhǔn)汞柱式血壓計測量收縮壓（SBP）和舒張壓（DBP）.使用SPIDA5型肺功能儀測量用力肺活量（FVC）和一秒用力呼氣容積（FEV1）.使用Nellcor NPB－40型脈氧儀測量SaO2.具體的生理表型見表1.

1.2.2 位點分型

采集隔夜空腹靜脈血，EDTA－Na2抗凝，紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，蛋白酶K 消化；酚抽提法提取基因組DNA，定量并標(biāo)化至10ng／μL.使用ABI公司的Taqman 基因分型試劑盒對選取的4個EGLN1SNPs分型.參照制造商的說明對樣本DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并使用ABI公司的7900HT型熒光定量PCR儀檢測熒光，并用ABI公司的SDS軟件對等位基因打分、聚類.隨機(jī)選取1%的樣本測序驗證，一致率為100%.

1.3 統(tǒng)計處理

所有的統(tǒng)計檢驗均在SPSS 20.0軟件上完成.Hardy－Weinberg平衡、兩組間等位基因頻率及基因型頻率比較采用卡方檢驗.基因型和表型的關(guān)聯(lián)分析采用方差分析和協(xié)方差分析.多重校正采用Bonferroni法.

2 結(jié)果

2.1 世居藏族EGLN1多態(tài)與高海拔水平的關(guān)聯(lián)

世居藏族EGLN1多態(tài)與高海拔水平的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果見表2（第486頁）.經(jīng)檢驗，4個SNPs均符合Hardy－Weinberg平衡.隨著海拔從2 700m 升高至3 700m 及4 700m，4個SNPs的常見等位基因頻率均顯著增加：例如，rs2790882－C 的頻率從LHA 組的52.5%，增加至MHA 組的60.0%，進(jìn)而增加至HHA 組的62.1%（P＜0.05）.在世居于不同水平高海拔的3個藏族人群中，4個SNPs各常見基因型的分布也均存在顯著差異（P＜0.05）：如rs2790882－CC 的頻率從LHA 組的29.4%增加至MHA 組的35.3%，進(jìn)而增加至HHA 組的36%（P＜0.05）.此外，隨著海拔逐漸升高，4個SNPs構(gòu)成的常見單倍型CTCC的頻率從LHA 組的52.5%，增加至MHA 組的59.8%，進(jìn)而增加至HHA 組的62.3%（P＝0.001 2）.以上結(jié)果經(jīng)年齡、性別和BMI調(diào)整及Bonferroni校正后仍然顯著.

表2 世居藏族EGLN1多態(tài)與高海拔水平的關(guān)聯(lián)Tab.2 Association between EGLN1SNPs and level of high altitude among native Tibetans

2.2 世居藏族EGLN1多態(tài)與SaO2水平的關(guān)聯(lián)

世居藏族EGLN1多態(tài)與SaO2水平的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果見表3.在HHA 組中，4個SNPs隨著少見純合子、雜合子和常見純合子其SaO2水平均依次升高，具有統(tǒng)計學(xué)差異.如rs2790882－TT 攜帶者、rs2790882－CT 者和rs2790882－CC者的SaO2水平依次從（81.57±3.93）升高到（82.76±4.43），進(jìn)而升高到（84.47±4.03）（P＝0.008）.此外，在HHA 組中，同4個SNPs構(gòu)成的少見單倍型TCTT 攜帶者（占62.3%）相比，常見單倍型CTCC攜帶者（占37.4%）的SaO2水平增加了1.6%（P＝0.001 5）.以上結(jié)果經(jīng)年齡、性別和BMI調(diào)整和Bonferroni校正后仍然顯著.除此之外，在LHA 組和MHA 組未發(fā)現(xiàn)各多態(tài)及單倍型攜帶者同SaO2相關(guān)，也未發(fā)現(xiàn)同其他表型相關(guān).

表3 不同水平高海拔世居藏族EGLN1多態(tài)與血氧飽和度的關(guān)聯(lián)Tab.3 Association between EGLN1polymorphisms and level of SaO2among native Tibetans from different levels of high altitude

（續(xù)表）

3 討論

EGLN1位于人類1號染色體長臂（1q42.2），長度約60.6kb，含有5個外顯子，編碼脯氨酸羥化酶2（Prolyl Hydroxylase Domain－containing protein 2，PHD2）［22］.PHD2以氧濃度依賴的方式負(fù)調(diào)控缺氧誘導(dǎo)因子1A 和2A（Hypoxia Inducible Factor－1A／2A，HIF1A／HIF2A）.常氧條件下，PHD2使HIFA 特定的脯氨酸殘基羥基化，使得HIFA 被VHL 泛素化裂解酶（von Hippel－Lindau ubiquitylation ligase）識別，并被送至蛋白酶體降解；低氧條件下，PHD2 的羥基化活性顯著降低，從而穩(wěn)定了HIF1A 和HIF2A［23］.HIFA 與HIFB結(jié)合成HIF轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)控糖酵解酶、血管內(nèi)皮生長因子、血紅素氧化酶、促紅細(xì)胞生成素等數(shù)百種基因表達(dá)，從而增強(qiáng)機(jī)體的低氧適應(yīng)性［24－25］.

本研究首次發(fā)現(xiàn)，EGLN1 4個SNPs常見等位基因及常見單倍型CTCC在世居藏族人群中隨著海拔進(jìn)一步升高頻率逐漸升高.據(jù)此推測，極端高海拔低氧壓力對世居于不同水平高海拔藏族人群的EGLN1基因變異具有選擇作用.一個可能的解釋是，在長期的高海拔低氧壓力下，常見單倍型CTCC可能更有利于適應(yīng)更高的低氧壓力，故在世居于較高海拔的藏族人群中得到富集，而且隨著海拔逐漸升高進(jìn)一步增加［26］，到4 700m 的極端高度時頻率最高（表4）.另外，我們在藏族人群中檢測出4個SNPs常見等位基因頻率在52.5%～62.4%范圍波動，同他人在高原全基因組研究［17］的頻率范圍類似，說明了本研究結(jié)果的可靠性.

表4 海拔關(guān)聯(lián)的EGLN1多態(tài)在藏族人與低海拔人種中的頻率Tab.4 Allele frequencies of the altitude－associated EGLN1SNPs in Tibetans and low altitude populations

全基因組研究發(fā)現(xiàn)，相對于低海拔人群，EGLN1在高原藏族人種中受到選擇；而我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，相對于同樣生活在高原的藏族人，隨著海拔從2 700m 升高至3 700m 及4 700m，EGLN1基因中至少覆蓋了17.6kb的CTCC單倍型進(jìn)一步被選擇.根據(jù)Xiang等［17］的假說，HIF2A和ELGN1可能在新石器時代早期一起傳入喜馬拉雅地區(qū)，HIF2A在藏族人進(jìn)入較低水平的高海拔（2 700～3 000m）時被選擇，而當(dāng)藏族人向更高水平的高海拔移民時，EGLN1可輔助其更順利地適應(yīng)更極端的高海拔低氧環(huán)境，從而被富集.以上結(jié)果提示海拔的升高對EGLN1的選擇是一個持久的、長期的過程.

本研究還發(fā)現(xiàn)，EGLN1 4個SNPs及單倍型的常見型可升高極端高海拔藏族人（HHA 組）的SaO2水平，而在世居于稍低水平高海拔的藏族人群（LHA 組和MHA 組）中觀察不到這一效應(yīng).我們推測，在極端高海拔低氧壓力下，EGLN1 4個SNPs常見變異可能與升高SaO2并進(jìn)一步增強(qiáng)機(jī)體生理適應(yīng)性有關(guān).另外，這些常見變異也可降低病理性表型如高原肺水腫（High Altitude Pulmonary Edema，HAPE）的發(fā)生.Mishra等［27］發(fā)現(xiàn)，同HAPE患者組相比，世居高原人群rs480902位點常見基因型頻率及SaO2水平均增加，而少見基因型頻率降低.Buroker等［28］對漢族急性高原?。ˋcute Mountain Sickness，AMS）的病例對照研究也發(fā)現(xiàn)，在AMS組中rs480902常見等位基因攜帶者的SaO2水平顯著高于少見型攜帶者，而對照組中無此變化.

雖然rs2790882、rs480902、rs2486736和rs2739513均位于EGLN1的內(nèi)含子區(qū)，它們可能通過某個連鎖位點調(diào)控EGLN1來影響機(jī)體SaO2水平.第一內(nèi)含子的變異可能以一種氧依賴的、影響可變剪接的方式影響EGLN1的轉(zhuǎn)錄水平［29－31］，并進(jìn)一步影響HIF1A和HIF2A的表達(dá)乃至SaO2水平，從而同對極端高海拔低氧壓力的適應(yīng)性相關(guān).但是，可能由于我們檢測出來的EGLN1基因變異效應(yīng)較弱，所以未在稍低海拔或其他表型中檢出陽性.

綜上，本研究首先發(fā)現(xiàn)極端的高海拔低氧壓力對藏族人群中的EGLN1基因變異的選擇信號.本研究也為EGLN1與高海拔低氧選擇壓力增加的關(guān)聯(lián)性提供了信息（在極高海拔EGLN1同SaO2水平相關(guān)），并佐證了全基因組研究中發(fā)現(xiàn)的EGLN1在藏族人群高原適應(yīng)中的作用.但是，本研究的結(jié)果需要進(jìn)一步的驗證.

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