銀杏葉提取物聯(lián)合噻嗎洛爾對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷的影響

摘要：目的觀察銀杏葉提取物(Extract of Ginkgo Biloba Leaves，EGb)聯(lián)合馬來(lái)酸噻嗎洛爾對(duì)大鼠慢性高眼壓視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells，RGCs)損傷的影響。方法選取健康SD大鼠50只，挑選平均眼壓在正常眼壓波動(dòng)范圍者45只納入實(shí)驗(yàn)，再隨機(jī)挑選10只為正常組，其余35采用烙閉3條鞏膜上靜脈的方法制作大鼠慢性高眼壓模型。從中選出眼壓穩(wěn)定在實(shí)驗(yàn)要求的大鼠30只隨機(jī)分為生理鹽水組、用藥組及聯(lián)合用藥組，各10只。所有大鼠8w后處死，制作光鏡及電鏡切片。電鏡下觀察視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化；AgNOR染色檢測(cè)RGCs的活性；TUNEL法檢測(cè)RGCs凋亡。結(jié)果生理鹽水組神經(jīng)節(jié)細(xì)胞在電子顯微鏡下結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞受損，治療組和聯(lián)合組神經(jīng)節(jié)細(xì)胞結(jié)構(gòu)只有微小的變化。正常組和聯(lián)合治療組RGCs銀染料粒子數(shù)量的核相比沒(méi)有顯著性差異(P st13 0.05);生理鹽水組和藥物組RGCs銀核染色顆粒顯著降低，與正常組和聯(lián)合治療組相比，有顯著性差異(P﹤0.05)，使用生理鹽水組，也有顯著性差異(P﹤0.05)。結(jié)論EGb對(duì)大鼠慢性高眼壓導(dǎo)致的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的損傷有一定的保護(hù)作用，聯(lián)合馬來(lái)酸噻嗎洛爾控制眼壓，對(duì)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的保護(hù)作用更突出。

關(guān)鍵詞：銀杏葉提取物；馬來(lái)酸噻嗎洛爾；慢性高眼壓；視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞

青光眼視神經(jīng)損傷機(jī)制目前尚未闡明，隨著基礎(chǔ)研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)不管損傷機(jī)制如何，它們最后的共同通路都是RGCs的凋亡[1]。臨床上青光眼患者雖然經(jīng)藥物或手術(shù)降低了眼壓， 但RGCs的凋亡、視神經(jīng)的損傷常常繼續(xù)發(fā)展， 甚至導(dǎo)致視力喪失。因此在控制眼壓的同時(shí)， 阻斷或降低RGCs的凋亡， 已成為青光眼治療的研究方向。我們通過(guò)建立大鼠慢性高眼壓模型，以EGb聯(lián)合噻嗎洛爾進(jìn)行干預(yù)，觀察EGb聯(lián)合噻嗎洛爾對(duì)大鼠慢性高眼壓視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷的影響，以期為青光眼的防治尋找新的方法。

1資料與方法

1.1一般資料健康SD(Sprague-Dawlay)大鼠50只（由懷化醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供），雌雄兼用，體重200～240g，8～12w齡，經(jīng)檢查無(wú)明顯歪頸，角膜透明，虹膜血管清晰，瞳孔等大等圓，對(duì)光反應(yīng)靈敏。TONO-PEN筆式眼壓計(jì) ，雙目手術(shù)顯微鏡 ，眼科手術(shù)顯微鏡，電子分析天平，透射電鏡 ，銀杏葉提取物，馬來(lái)酸噻嗎洛爾眼液，AgNOR染色，TUNEL試劑盒。

1.2方法正式實(shí)驗(yàn)前常規(guī)飼養(yǎng)3d，定期測(cè)眼壓， 挑選出平均眼壓在正常眼壓波動(dòng)范圍（9～16mmHg）者45只納入實(shí)驗(yàn)。45只SD大鼠隨機(jī)挑選10只為正常組，其余35只采用烙閉3條新方法使老鼠在鞏膜靜脈慢性高眼壓模型[2]。體積分?jǐn)?shù)為10%水合氯醛麻醉大鼠腹腔內(nèi)注射0.3ml/kg的深度，1%地卡因眼行兩次眼表面麻醉，切開(kāi)顯微鏡和右顳結(jié)膜鞏膜暴露淺靜脈，鼠眼球鼻側(cè)，顳側(cè)，顳淺靜脈和顳下各有一個(gè)，走線(xiàn)更直，燃燒在時(shí)間方面，時(shí)間和第三條下顳淺靜脈，立即收縮血管，其遠(yuǎn)端血流中斷，結(jié)膜切口不做縫合，結(jié)膜囊內(nèi)涂典必殊眼膏。觀察1w，定期測(cè)量眼壓，從中選出眼壓穩(wěn)定在實(shí)驗(yàn)要求（眼壓＞24 mmHg）的大鼠30只隨機(jī)分為生理鹽水組、用藥組及聯(lián)合用藥組，各10只。光鏡下觀察RGCs細(xì)胞核內(nèi)黑色銀染顆粒情況。選擇每個(gè)切片中的4個(gè)不同高倍視野進(jìn)行圖象分析，計(jì)數(shù)銀染顆粒（計(jì)數(shù)RGCs細(xì)胞核內(nèi)銀染顆?？倲?shù)和RGCs個(gè)數(shù)，計(jì)算出單個(gè)節(jié)細(xì)胞內(nèi)銀染顆粒平均個(gè)數(shù)），求4個(gè)視野的平均值。隨機(jī)在每組取18張切片(每標(biāo)本取2張)，切片脫蠟用二甲苯浸洗2次，嚴(yán)格按照TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行操作，每個(gè)片在四個(gè)不同的圖像分析角度來(lái)看，高功率雙筒顯微鏡(400倍)，計(jì)算凋亡陽(yáng)性細(xì)胞和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的總數(shù)，每組陽(yáng)性細(xì)胞的平均數(shù)量和平均總數(shù)量的細(xì)胞，細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)、人工智能(%)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總×100%。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用SPSS17.0軟件包行兩樣本均數(shù)t檢驗(yàn)及單因素方差分析(LSD法)，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1電鏡下觀察大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化正常組:正常視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)是明確的。神經(jīng)節(jié)細(xì)胞胞核圓形或卵圓形，中心，染色質(zhì)清晰，顏色均勻分布，胞漿豐富的細(xì)胞器，線(xiàn)粒體及其峰值，核糖體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正常形式，細(xì)胞膜的完整性。治療組:一些神經(jīng)節(jié)細(xì)胞核染色質(zhì)聚集，胞質(zhì)細(xì)胞器在線(xiàn)粒體數(shù)量略少，糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核糖體，線(xiàn)粒體腫脹的一部分，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)空泡變性，部分線(xiàn)粒體嵴消失，細(xì)胞膜的完整性。

2.2 AgNOR染色可見(jiàn)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外組織被染成黃色，染細(xì)胞核，邊界清晰，細(xì)胞核的色散可以看到一個(gè)或多個(gè)AgNOR小黑點(diǎn)，有時(shí)可見(jiàn)許多微小粒子合并成不規(guī)則的面包屑。正常組和聯(lián)合治療組大鼠眼RGCs核銀染料顆粒分布均勻，可數(shù)量的銀染色粒子在兩組之間沒(méi)有顯著性差異(P st13 0.05);生理鹽水組和治療組大鼠眼RGCs銀核染色顆粒顯著降低，與正常組和聯(lián)合治療組相比，有顯著性差異(P﹤0.05)，包括藥物RGCs銀染色粒子在原子核鹽水組，也有顯著性差異(P﹤0.05)。

2.3 TUNEL法檢測(cè)RGCs凋亡結(jié)果光學(xué)顯微鏡下TUNEL陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞核呈棕黃色。正常組大鼠眼視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層偶爾TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞，積極核淺;生理鹽水組大鼠眼視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量明顯增加，陽(yáng)性細(xì)胞染色深，人工智能與正常組相比有顯著性差異(P<0.05);眼藥物組和聯(lián)合治療組大鼠TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量小于生理鹽水組，陽(yáng)性細(xì)胞核是淺，人工智能與正常組和生理鹽水組相比差異顯著(P<0.05);人工智能組合組AI與觀察組相比有顯著性差異(P<0.05)。

3討論

青光眼是一組以特征性視神經(jīng)萎縮和視野缺損為共同特征的疾病，長(zhǎng)期以來(lái)一直認(rèn)為青光眼是由神經(jīng)視神經(jīng)疾病以外的因素造成的。最普遍認(rèn)為高眼壓青光眼的發(fā)病機(jī)制是最危險(xiǎn)的因素，所以在過(guò)去的很多研究專(zhuān)注于降低眼壓。然而，許多甚至青光眼患者眼壓降至正常范圍，神經(jīng)損傷持續(xù)[3，4]，視力還迷路。這些現(xiàn)象表明，高眼壓不是唯一的因素，青光眼可能還有其他危險(xiǎn)因素。通過(guò)基礎(chǔ)和臨床研究的積累和深化，人們青光眼有更深層次的理解，認(rèn)為青光眼視功能損傷是多種因素的結(jié)果，機(jī)制，純粹從降低眼壓青光眼治療的角度可能延緩疾病的發(fā)展和減少視覺(jué)受損，但沒(méi)有足夠的治療[5]。因此，青光眼的治療應(yīng)該在降低眼壓的基礎(chǔ)上使用特殊方法推遲或阻止視神經(jīng)損傷和保護(hù)視力。為數(shù)眾多的研究已經(jīng)表明，青光眼視神經(jīng)的損害是由于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡，是不可逆轉(zhuǎn)的視力損害的主要原因，高眼壓或低血流灌注壓力導(dǎo)致缺血、缺氧，等等，光纖神經(jīng)軸漿流中斷，進(jìn)一步導(dǎo)致供應(yīng)中斷目標(biāo)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，同時(shí)產(chǎn)生更多的興奮性毒素，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡基因激活的同時(shí)，作用于細(xì)胞表面受體，如NMDA受體，出現(xiàn)大量的鈣離子內(nèi)流，鈣超載，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，引起一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致DNA，細(xì)胞變性凋亡發(fā)生，導(dǎo)致青光眼視神經(jīng)損害[6]。

我們采用烙閉大鼠3條鞏膜上靜脈的方法建立大鼠慢性高眼壓模型，參照EGb的藥物安全劑量及先前對(duì)EGb的研究[10]，用灌胃的方式(150mg/kg)，1次/d，聯(lián)合馬來(lái)酸噻嗎洛爾眼液進(jìn)行視神經(jīng)的保護(hù)性干預(yù)，結(jié)果表明:電子顯微鏡下正常組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞大量死亡生理鹽水組，細(xì)胞邊界不清楚，核固縮、胞質(zhì)空泡，細(xì)胞器消失，大部分治療組神經(jīng)節(jié)細(xì)胞也嚴(yán)重退化，但沒(méi)有看到一群死細(xì)胞和炎癥細(xì)胞，在聯(lián)合治療組和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞只有輕微損傷;AgNOR染色正常組和聯(lián)合治療組大鼠眼RGCs顆粒分布均勻，可銀染色細(xì)胞核的兩組之間沒(méi)有顯著差異銀染料顆粒數(shù)量(P st13 0.05)，與生理鹽水組和治療組大鼠眼RGCs銀染色的核粒子顯著降低，與正常組和聯(lián)合治療組相比，有顯著性差異(P﹤0.05)，治療組與生理鹽水組相比RGCs銀核染色顆粒，也有顯著性差異(P﹤0.05)。TUNEL法檢測(cè)AI RGCs凋亡的結(jié)果從高到低依次是生理鹽水組、治療組和聯(lián)合組和正常組，比較兩個(gè)顯著(P﹤0.05)。這些有力地證明了，EGb能阻斷慢性高眼壓狀態(tài)下視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞有一定的保護(hù)作用，聯(lián)合馬來(lái)酸噻嗎洛爾眼液控制眼壓，這種保護(hù)作用更為突出。

參考文獻(xiàn):

[1]Nickells RW .Retinal ganglion cell death in glaucoma: the how，the why，and the maybe [J].J Glaucoma，1996，5:345.

[2]段曉明，徐冬冬，王帥，等.大鼠慢性高眼壓模型的實(shí)驗(yàn)研究[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào)( 醫(yī)學(xué)版)，2011，30(3):422-426.

[3]夏翠然.青光眼視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷及保護(hù)[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)·眼科學(xué)分冊(cè)，2001，25(1):36.

[4]包輝英，吳國(guó)忠.中藥治療青光眼研究進(jìn)展[J].實(shí)用中醫(yī)藥雜志，2004，20（5）：278.

[5]葛堅(jiān).青光眼的研究進(jìn)展與發(fā)展趨勢(shì)[J].中華眼科雜志，2000，36（3）：192-196.

編輯/申磊