論著辛伐他汀聯(lián)合PMA對(duì)SHI-1細(xì)胞增殖與凋亡的影響

摘要： 目的探討羥甲基戊二酸單酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶的抑制劑辛伐他?。⊿V）聯(lián)合佛波酯（PMA）對(duì)SHI-1細(xì)胞增殖，分化與凋亡的影響，以及WT1/hDMP1基因的表達(dá)變化。 方法以不同濃度辛伐他汀單獨(dú)或聯(lián)合PMA處理SHI-1細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。各組細(xì)胞分別進(jìn)行MTT法觀察細(xì)胞增殖能力；流式細(xì)胞測(cè)定SHI-1細(xì)胞凋亡指標(biāo)AnnexinⅤ/propidium iodide變化； Real-time RT-PCR測(cè)定WT1/hDMP1基因表達(dá)變化。結(jié)果 15μmol/LSV，10μmol/LSV單獨(dú)處理SHI-1細(xì)胞，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞抑制率增加（F=24.61，P=0.000），AnnexinV表達(dá)水平逐漸增高（F=5.69，P=0.018），WT1表達(dá)水平逐漸降低（F=12.20，P=0.008），同時(shí)伴隨著hDMP1表達(dá)水平的增加（F=23.81，P=0.000），其中以15μmol/LSV聯(lián)合PMA處理SHI-1細(xì)胞培養(yǎng)72h細(xì)胞抑制率最為明顯。結(jié)論辛伐他汀體外抑制SHI-1細(xì)胞的增殖，促進(jìn)SHI-1細(xì)胞的分化及凋亡，降低WT1表達(dá)，升高h(yuǎn)DMP1表達(dá)，提示辛伐他汀具有協(xié)同治療急性單核細(xì)胞白血病的潛能。

關(guān)鍵詞：辛伐他汀；SHI-1細(xì)胞；佛波酯；增殖；凋亡；WT1；hDMP1

Proliferation and Apoptosis Effects of Simvastatin Combined with PMA in Human Monocytic Leukemia Cell Line SHI-1

JIANG Ting-xiu1， CHEN Hong1，GU Wei-ying2， QIU Guo-qiang2， WANG Zhi-lin2， HE Bai2

（1.Department of Hematology ，The forth affiliated hospital of Guangxi Medical University，Liuzhou 545005，Guangxi，China;2.Department of Hematology，The First People，s Hospital of Changzhou， Third Affiliated Hospital of Suzhou University，Changzhou 213003，Jiangsu，China）

Abstract：ObjectiveTo investigate the effect ofSimvastatin(SV) combined with Phorbol-12-myristate-13-acetate(PMA) on the proliferation ，differentiation，apoptosis and WT1/hDMP1 gene expression profiles of human monocytic leukemia cell line SHI-1. MethodsSHI-1 cells were incubated with Simvastatin and PMA solely or in combination， Cells of different groups were collected after incubation for further detection．M'IT method was used to assay the growth inhibition rate and cytoflowmetry was used to detect the early stage apoptosis ratio and cell necrosis ratio．Real-time quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction(RT-PCR) was used to detect the WT1/hDMP1 gene expression levels. ResultsTreated with 15μmol/LSV and 10μmol/LSV in each， with the SHI-1 cells growth， the cell inhibition rates gradually increased(F=24.61，P=0.000)， and AnnexinV expression levels(F=5.69，P=0.018)， however the WT1 expression levels gradually decreased (F=12.20，P=0.008)，paralleled with hDMP1 expressionlevels increased in reverse(F=23.81，P=0.000)，furthermore the SHI-1 cells treated with Combination of 15μmol/LSV with 5ng/L PMA displayed obvious interaction for cell growth inhibition and Annexin V expression were found.ConclusionSimvastatin in vitro inhibited SHI-1 cell proliferation， induced cell differentiation and promoted cell apotosis， as well as decreased the WT1 expression and increased hDMP1 expression dose-dependently， indicating that simvastatin has the synergistic anti-monocytic potency in vitro.

Key words：Simvastatin;SHI-1 cell;Phorbol-12-myristate-13-acetate;Proliferation;Apoptosis;WT1; hDMP1

辛伐他?。⊿V）作為羥甲基戊二酸單酰輔酶A (HMG-coA)還原酶的抑制劑已普遍用于臨床治療高膽固醇血癥?，F(xiàn)在已有證據(jù)表明SV具有多效性，除了降低血脂外，還具有抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡、抗血管生成、抑制腫瘤細(xì)胞遷移等生物學(xué)作用[1]。目前文獻(xiàn)關(guān)于辛伐他汀體外抑制急性單核細(xì)胞白血病效應(yīng)報(bào)道甚少，因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分子生物學(xué)手段觀察辛伐他汀對(duì)SHI-1細(xì)胞增殖、分化和凋亡及WT1/hDMP1基因表達(dá)變化，以進(jìn)一步探討辛伐他汀抗急性單核細(xì)胞白血病效應(yīng)及可能的機(jī)制。

1資料與方法

1.1細(xì)胞的培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組 人急性單核白血病細(xì)胞株SHI-1為蘇州大學(xué)血液研究所陳蘇寧博士惠贈(zèng)。在10%FBS的1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中，每3d換液1次。取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整濃度至2×l05/mL，辛伐他汀分15μmol/L (15SV)，10μmol/L(10SV)兩個(gè)濃度梯度，PMA為5ng/L。實(shí)驗(yàn)分組如下： 15μmol/L SV組、10μmol/L SV組、PMA組、PMA+15μmol/L SV組、PMA+10μmol/L SV組、以SHI-1細(xì)胞為空白對(duì)照組。藥物作用24h，48h，72 h后收集各組細(xì)胞用于檢測(cè)。

1.2方法

1.2.1MTT法檢驗(yàn)藥物對(duì)SHI-1細(xì)胞抑制作用將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SHI-1細(xì)胞接種于96孔板中，濃度為2×105/ml，然后加入不同濃度的SV和PMA，每孔100μL，分組如上所述，每組有3個(gè)復(fù)孔?？瞻讓?duì)照孔加RPMI 1640培養(yǎng)液100μL。培養(yǎng)24，48，72 h后，分別加入5mg/mL MTT液15μL，再37℃孵育4 h后加入0.04 mmol/L酸化異丙醇100μL溶解結(jié)晶，于490nm波長(zhǎng)處用用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度(A)值。計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。生長(zhǎng)抑制率%= ［1－（A實(shí)驗(yàn)組－A空白對(duì)照組）/（A陰性對(duì)照組－A空白對(duì)照組）］%。

1.2.2檢測(cè)細(xì)胞分化及凋亡取1000000個(gè)細(xì)胞，預(yù)冷的PBS洗兩次（2000r/5min），然后加入 10μL的AnnexinV 緩沖液用于懸浮細(xì)胞后再分別加入5μLAnnexinⅤ-FITC，5μLPI-PE，混勻，于遮光處放置15min，再加AnnexinV 緩沖液500μL，2000r/min，離心5 min。用FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)SHI-1細(xì)胞的分化與凋亡。

1.2.3檢測(cè)WT1和hDMP1藥物處理后細(xì)胞中表達(dá)的變化各組細(xì)胞培養(yǎng)后24，48 ，72h后收集1×106個(gè)SHI-1細(xì)胞。按RNA提取試說(shuō)明書(shū)操作提取總RNA，在紫外分光光度儀中定量；RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA， 逆轉(zhuǎn)錄體系20μL，其中總RNA 2μg。GAPDH、hDMP1PCR反應(yīng)體系為：總體積為25μl，cDNA2μL，10×buffer 2.5μL，25 mmol/LMgCl2 2 .5μL，10mmol/L dNTP 0.5μL， 5u/μLTaq酶0.25μL，100μmol/L引物探針各0.1μL，加雙蒸水補(bǔ)足反應(yīng)總體積為25 L 。反應(yīng)條件為： 95℃ 5 min熱啟動(dòng)，然后95℃ 10 s變性。58℃ 15 s退火延伸，40個(gè)循環(huán)，58℃延伸時(shí)采集熒光信號(hào)。WT1的反應(yīng)體系為：總體積為25μl，cDNA2μL，10×buffer 2.5μL，25 mmol/LMgCl21 .5μL，10mmol/L dNTP 0.5μL，5u/μLTaq酶0.5μL，100μmol/L引物探針各0.1μL，反應(yīng)總體積為25 L 。反應(yīng)條件為： 50℃ 3min預(yù)變性，95℃ 5 min熱啟動(dòng)。然后95℃ 20 s變性。60℃ 60 s退火延伸，40個(gè)循環(huán)，60℃延伸時(shí)采集熒光信號(hào)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析各實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，采用SPSS16.0軟件進(jìn)行隨機(jī)化區(qū)組設(shè)計(jì)和單因素方差分析。以P<0.05為具有顯著性差異，P<0.01為具有非常顯著性差異。

2結(jié)果

2.1 SV單獨(dú)或聯(lián)合PMA處理 SHI-1細(xì)胞的抑制率變化協(xié)方差分析MTT結(jié)果顯示15μmol/LSV和10μmol/LSV單獨(dú)處理SHI-1細(xì)胞，隨著辛伐他汀培養(yǎng)濃度增加，培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞抑制率逐漸增加（F=24.61，P=0.000）。15μmol/LSV聯(lián)合PMA處理SHI-1細(xì)胞72h后細(xì)胞抑制率（83.2±5.1%）較單用15μmol/LSV（63.9±4.7， P=0.000）和PMA（35.4±3.1%，P=0.000）明顯升高。提示了辛伐他汀以時(shí)間和劑量依賴方式抑制SHI-1細(xì)胞的增殖，且與PMA聯(lián)用具有協(xié)同抑制增殖的作用，其中以15μmol/LSV的聯(lián)合抑制作用最強(qiáng)(見(jiàn)表1)。

2.2辛伐他汀聯(lián)合PMA處理SHI-1后的細(xì)胞凋亡率變化流式檢測(cè)不同濃度辛伐他汀單獨(dú)或聯(lián)合PMA處理SHI-1細(xì)胞的AnnexinV/propidium iodide的結(jié)果顯示了隨著辛伐他汀濃度增加，培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞的凋亡率逐漸增大（F=5.69，P=0.018），PMA處理SHI-1細(xì)胞培養(yǎng)24，48，72hAnnexinV表達(dá)水平與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.80，P=0.474），提示PMA無(wú)促進(jìn)SHI-1細(xì)胞凋亡作用。15μmol/L辛伐他汀聯(lián)合PMA處理SHI-1細(xì)胞培養(yǎng)72hAnnexinV表達(dá)水平（28.43±1.34%）明顯較PMA（4.34±1.07%， P=0.000）和15μmol/L SV單藥處理明顯升高（15.59±0.95%，P=0.000），提示辛伐他汀可以協(xié)同PMA促進(jìn)SHI-1細(xì)胞凋亡作用（見(jiàn)圖1）。

圖 1辛伐他汀單用或聯(lián)合PMA處理SHI-1細(xì)胞的早期凋亡率變化

2.3辛伐他汀處理后SHI-1細(xì)胞中WT1和hDMP1基因表達(dá)水平變化實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)SHI-1細(xì)胞中WT1和hDMP1表達(dá)水平的結(jié)果顯示：隨著辛伐他汀濃度增加，培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，WT1表達(dá)水平反而下降（F=12.20，P=0.008），反之， h DMP1表達(dá)水平逐漸升高（F=23.81，P=0.000）。15μmol/LSV聯(lián)合PMA處理SHI-1細(xì)胞培養(yǎng)48h WT1N(WT1*104/ GAPDH)表達(dá)水平（0.74±0.06）較單用SV（4.28±0.38，P=0.020）和PMA（1.39±0.12，P=0.036）具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，即SV與PMA具有協(xié)同降低SHI-1細(xì)胞WT1表達(dá)；15μmol/LSV聯(lián)合PMA處理SHI-1細(xì)胞培養(yǎng)72 h hDMP1N(h DMP1*104/ GAPDH)（648.1±26.0） 表達(dá)較15SV（65.04±3.58，P=0.003）和PMA（34.55±1.35，P=0.005）單藥處理明顯升高，兩藥具有明顯協(xié)同作用，提示15μmol/LSV聯(lián)合PMA具有共同促進(jìn)SHI-1細(xì)胞凋亡過(guò)程中WT1基因表達(dá)下降和h DMP1表達(dá)增加（見(jiàn)表2）。

注：SV辛伐他汀，WT1N表達(dá)水平以WT1*104/ GAPDH表示，h DMP1N表達(dá)水平以h DMP1*104/ GAPDH

3討論

SHI-1細(xì)胞株具有特征性t ( 6；11)表型異常，表達(dá)MLL/AF6 融合基因，并伴有p53基因缺失，成為白血病研究的一個(gè)新的有價(jià)值的工具。通過(guò)比較他汀對(duì)ATRA抵抗的HL-60-R2細(xì)胞株和HL-60的細(xì)胞株，報(bào)道了他汀類藥物對(duì)HL-60-R2的細(xì)胞殺傷作用比ATRA敏感的HL-60細(xì)胞株強(qiáng)2倍，在實(shí)驗(yàn)所用的他汀類藥物中，辛伐他汀的致細(xì)胞凋亡作用最強(qiáng)，其作用機(jī)制與細(xì)胞內(nèi)活性氧類物質(zhì)（reactive oxygen species，ROS）的蓄積，線粒體損傷，胞外細(xì)胞色素c的釋放引起線粒體凋亡通路的活化有關(guān)[11]。曾經(jīng)有報(bào)道認(rèn)為他汀類藥物可以增加ATRA抵抗的NB4.300/6細(xì)胞株對(duì)ATRA的敏感性 [9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)辛伐他汀以時(shí)間和劑量依賴方式抑制SHI-1細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞分化與凋亡，其中以15μmol/LSV作用最強(qiáng)；且與PMA聯(lián)用具有協(xié)同抑制增殖和促進(jìn)凋亡作用；研究結(jié)果提示了辛伐他汀具有殺傷單核細(xì)胞白血病細(xì)胞作用，與文獻(xiàn)報(bào)道相符合。

hDMP1對(duì)于P19ARF -P53凋亡通路的作用是正向調(diào)控，因此，被認(rèn)為具有抑制腫瘤的增殖作用[7]。WT1基因作為腫瘤抑制基因或者癌基因存在，但最近的報(bào)道認(rèn)為WT1無(wú)論是在兒童還是承認(rèn)急性髓系白血病中，OS或者EFS都較無(wú)WT1突變組的差[12， 13]。也有文獻(xiàn)報(bào)道在ATRA和PMA誘導(dǎo)急性白血病細(xì)胞株分化之后，WT1表達(dá)降低了70%~90%，同時(shí)伴隨有h DMP1表達(dá)增加了1.9~7.4倍[8]。由于SHI-1細(xì)胞中WT1基因基礎(chǔ)表達(dá)水平較低，前期研究結(jié)果提示其表達(dá)水平明顯低于K562和NB4細(xì)胞[14]，本實(shí)驗(yàn)中在辛伐他汀聯(lián)合PMA處理SHI-1細(xì)胞培養(yǎng)72h后WT1基因小于最低檢出限(在48h的時(shí)候降低了97%)，因此表2中未顯示相應(yīng)數(shù)據(jù)，而hDMP1表達(dá)增加了12.99倍，提示辛伐他汀促進(jìn)SHI-1細(xì)胞分化過(guò)程中，WT1基因表達(dá)水平下降伴隨著hDMP1表達(dá)增加。由于SHI-1細(xì)胞伴有p53基因缺失，推測(cè)辛伐他汀誘導(dǎo)SHI-1白血病細(xì)胞凋亡通過(guò)其他凋亡途徑實(shí)現(xiàn)，而非通過(guò)下調(diào)WT1癌基因表達(dá)，上調(diào)h DMP1基因表達(dá)從而激活P19ARF -P53凋亡通路而實(shí)現(xiàn)。

綜上所述，辛伐他汀可以抑制SHI-1細(xì)胞增殖，促進(jìn)分化與凋亡，同時(shí)可以協(xié)同PMA抑制SHI-1細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡，為辛伐他汀協(xié)同治療AML提供理論依據(jù)，但尚需進(jìn)一步探討其抗白血病效應(yīng)機(jī)制。

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