川崎病急性期血細(xì)胞因子的變化

摘要：目的 為臨床提供較好的兒童川崎病急性期細(xì)胞因子濃度變化的證據(jù)。方法 采被試兒童包括KD組（32例）和對(duì)照組（32例）靜脈血，測(cè)定血樣標(biāo)本中腫瘤壞死因子-α（TNF-α），干擾素-γ（INF-γ）和白細(xì)胞介素-12（IL-12）的含量。并用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析兩組兒童外周血中三種細(xì)胞因子是否有顯著性差異。結(jié)果 通過(guò)計(jì)算實(shí)驗(yàn)組患兒外周血TNF-α，INF-γ和IL-12的含量均高于對(duì)照組兒童。結(jié)論 通過(guò)對(duì)TNF-α，INF-γ和IL-12的監(jiān)測(cè)，可以有效的了解畸川病患兒疾病進(jìn)展，治療效果和預(yù)后情況。

關(guān)鍵詞：川崎??；腫瘤壞死因子-α；干擾素-γ；白細(xì)胞介素-12

川崎病(KD)又名皮膚粘膜淋巴結(jié)綜合征，是一種原因不明確的兒童常見的自身免疫性血管炎綜合征，其主要并發(fā)癥為嚴(yán)重的心血管系統(tǒng)損害，尤其是冠狀動(dòng)脈病變，目前在美國(guó)、日本及我國(guó)川畸病已取代了急性風(fēng)濕病作為兒童后天獲得性心臟病的最主要原因[1]。近年，細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α），干擾素-γ（INF-γ）和白細(xì)胞介素-12（IL-12）在川崎病診斷、鑒別診斷及療效判斷中受到關(guān)注。本研究對(duì)32例川崎病急性期患兒靜脈血中三種細(xì)胞因了的檢測(cè)，現(xiàn)報(bào)告如下：

1資料與方法

1.1一般資料 2011年6月到2013年6月，到我院診治的32名川畸病患兒為實(shí)驗(yàn)組。根據(jù)臨床表現(xiàn)以及血液學(xué)和影像學(xué)提示，32例患兒均符合急性期KD的診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]。其中男18例，女14例，中位年齡6.5（2～15歲）。對(duì)照組選擇同期到我院體檢中心體檢的正常兒童，共32例，男女比例選擇與實(shí)驗(yàn)組相似。男19例，女12例，中位年齡7.1（2～16）。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本收集 用肝素鈉抗凝管采集患者和對(duì)照組兒童的靜脈血10ml.其中5ml用于TNF-α，另5ml用于IL-12的測(cè)定。再取用無(wú)肝素采集管采集15ml用于INF-γ測(cè)定。

1.2.2 TNF-α含量的測(cè)定 以鼠源性的抗TNF-α單抗以每孔400ng的量，在PH9的碳酸-碳酸鈉緩沖液中包被96孔板中，并4℃過(guò)夜。取出后洗滌3次，加入預(yù)先備好的待測(cè)樣本及標(biāo)準(zhǔn)的TNF-α(制作標(biāo)準(zhǔn)曲線用)。37℃孵育2h。用洗滌液洗滌3次，加入羊抗鼠TNF-α抗體，37℃孵育2h后，再洗滌3次，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊IgG，37℃孵育2h后加入底物顯色。終止顯色后在自動(dòng)酶標(biāo)儀上測(cè)定濃度，并以標(biāo)準(zhǔn)曲線為基準(zhǔn)求得TNF-α的含量。以Mean±SDng/ml的形式表示結(jié)果。

1.2.3 INF-γ含量測(cè)定 將上述采得的用于INF-γ測(cè)定的靜脈血在室溫凝固30min，1000r/min離心15min，收集血清。檢測(cè)IFN-α用人IFN-α檢測(cè)Elisa試劑盒，操作步驟為分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣50μl，待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測(cè)樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。用封板膜封板后置37℃溫育30min。將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外。再用封板膜封板后置37℃溫育30min。小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15min。每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。以空白孔調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。終止顯色后在自動(dòng)酶標(biāo)儀上測(cè)定濃度，并以標(biāo)準(zhǔn)曲線為基準(zhǔn)求得IFN-α的含量。以Mean±SD ng/ml的形式表示結(jié)果.

1.2.4IL-12含量測(cè)定 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELBA)試劑盒購(gòu)自武漢博士德試劑公司，其他常規(guī)試劑由實(shí)驗(yàn)中心配置，全自動(dòng)酶標(biāo)儀由意大利希亞克公司生產(chǎn)。采用雙抗體夾心ELISA測(cè)定血清IL-12的濃度，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書。采用速率散射比濁法檢測(cè)hs-CRP和CP含量，使用Beckman公司Array一360特定蛋白分析儀，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料采用均x±s表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較對(duì)照組和不同時(shí)間窗KD組的細(xì)胞因子的差異。以P＜0.05 為差異有顯著性。

2結(jié)果

2.1TNF-α含量的對(duì)比結(jié)果 KD組患兒外周血中TNF-α含量的平均值是：(56.31±20.12) ng/ml，而對(duì)照組的患兒的平均值為(25.28±10.41 )ng/ml。通過(guò)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，P=0.008＜0.05，差異具有顯著性。

2.2 INF-γ含量的對(duì)比結(jié)果 KD組患兒外周血中INF-γ含量的平均值是：(22.2±9.42)ng/ml，而對(duì)照組的患兒的平均值為(8.37±10.21)ng/ml。通過(guò)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，P=0.001＜0.05。

2.3 IL-12含量的對(duì)比結(jié)果 KD組患兒IL-12含量平均為：(35.64±14.16)pg/ml，對(duì)照組患兒外周血中IL-12含量平均為：(21.02±4.50)pg/ml。通過(guò)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，P=0.012＜0.05。

3討論

川崎病(KD)是兒童期一種常見免疫相關(guān)性血管炎綜合征，有逐年增多趨勢(shì)，目前認(rèn)為KD是小兒獲得性心臟病的主要病因[3]。到目前為止雖然川崎病精確的發(fā)病機(jī)制還沒(méi)有被完全的闡明，但是大量證據(jù)表明Ｔ細(xì)胞介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)異常在川崎病的發(fā)病機(jī)理中發(fā)揮了重要的作用。

腫瘤壞死因子，是目前為止抗腫瘤能力最強(qiáng)的細(xì)胞因子，也是被研究得最多。它是單核-巨噬細(xì)胞分泌的單核細(xì)胞刺激因子，在炎癥和免疫反應(yīng)中起著重要的作用。研究表明，川崎病患者體內(nèi)TNF的含量有明顯增加[4]。在正常情況下 ，TNF-α濃度較低，適量的TNF-α對(duì)機(jī)體有保護(hù)作用，在疾病的病理改變下，TNF-α大量分泌，以致對(duì)機(jī)體產(chǎn)生損害作用。至于是否還有其它因素影響，尚待進(jìn)一步探討[5]。本研究的結(jié)果為川崎病兒童體內(nèi)外周血TNF-α含量顯著高于正常兒童含量提供了臨床依據(jù)。

INF-γ主要由輔助T(Th)細(xì)胞產(chǎn)生，INF-γ是可調(diào)節(jié)Th細(xì)胞極化的細(xì)胞因子 。在這種調(diào)節(jié)機(jī)制中， 細(xì)胞分泌的INF-γ 發(fā)揮著十分重要的作用，能顯著地促進(jìn)Th1應(yīng)答，且抑制Th2應(yīng)答[6]。升高的機(jī)理可能是患兒血清中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子水平明顯低于正?；純?，也可能是由于患兒外周血T、B淋巴細(xì)胞調(diào)節(jié)紊亂，機(jī)體的免疫功能發(fā)生川崎病的原因。在我們這次研究中，也可以看到川崎病患兒外周血中的INF-γ的含量與對(duì)照組患兒體內(nèi)INF-γ的含量差異具有顯著性。這里后期應(yīng)該追加急性川崎病和慢性川崎病患兒體內(nèi)外周血INF-γ含量比較的研究，以提供更完善的證據(jù)證明INF-γ的含量可以反映再障疾病的嚴(yán)重程度。

IL-12是啟動(dòng)Th1細(xì)胞的重要因子。而IL-12協(xié)同其他的細(xì)胞因子組成的細(xì)胞因子網(wǎng)可以決定機(jī)體免疫應(yīng)答的類型。本次研究的結(jié)果顯示川崎病患兒外周血IL-12的含量明顯高于對(duì)照組正常兒童的含量。提示IL-12在川崎病的發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程中具有一定的作用。已經(jīng)有研究證實(shí)，IL-12可以誘導(dǎo)Th1細(xì)胞分泌INF-γ[7]。本次研究只是做了川崎病患兒與正常兒童IL-2的差別的研究，并沒(méi)有研究IL-2含量的高低與病情嚴(yán)重程度的關(guān)系。要得到這方面的結(jié)果，需在今后的研究中進(jìn)行急慢性川崎病患兒細(xì)胞因子的對(duì)比和相關(guān)性研究。

綜上所述，在川崎病患兒的疾病發(fā)展過(guò)程中，通過(guò)對(duì)TNF-α、INF-γ和IL-2的監(jiān)測(cè)，可以有效的了解疾病的病情、治療效果和疾病的預(yù)后，具有重要的臨床意義。本次研究的結(jié)果，為研究川崎病的新治療靶點(diǎn)提供了有效的臨床依據(jù)。同時(shí)，也啟發(fā)我們發(fā)現(xiàn)了一些新的研究思路，有助于我們將來(lái)更好的認(rèn)識(shí)，特別是兒童這個(gè)特殊群體的川崎病。

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