體外培養(yǎng)人脂肪來源干細(xì)胞增殖及成脂分化應(yīng)用富血小板血漿的效果分析

摘要：本文通過探究體外培養(yǎng)人脂肪來源干細(xì)胞增殖及成脂分化應(yīng)用富血小板血漿的效果觀察。所選資料隨機(jī)選自無傳染病和內(nèi)分泌病的成人腹部和大腿脂肪的脂質(zhì)提取的人脂肪來源干細(xì)胞，把細(xì)胞分成研究組和對(duì)照組，研究組予以不同濃度自體富血小板的血漿培養(yǎng)液的條件干預(yù)，對(duì)照組未予以富血小板的血漿培養(yǎng)液，分析細(xì)胞的形態(tài)學(xué)、細(xì)胞的增殖以及細(xì)胞的成脂活性。通過分析研究組細(xì)胞胞漿豐富、胞體豐滿，密度比較大；研究組和對(duì)照組培養(yǎng)增殖OD值差異明顯（P＜0.05），其中研究組10%PRP增殖最顯著；同時(shí)研究組染色分化比例（45.9±6.3）%，對(duì)照組分化比例（16.2±5.1）%，比較差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)上的意義（P＜0.05）。認(rèn)為對(duì)人脂肪來源干細(xì)胞體外培養(yǎng)，予自體富血小板的血漿培養(yǎng)液的條件干預(yù)，能有效促進(jìn)細(xì)胞的增殖及成脂分化相關(guān)活性，具有一定臨床應(yīng)用和研究?jī)r(jià)值。

關(guān)鍵詞：人脂肪來源干細(xì)胞；成脂分化；富血小板血漿

本文主要對(duì)無傳染病和內(nèi)分泌病的成人腹部和大腿脂肪的脂質(zhì)提取的人脂肪來源干細(xì)胞（ADSCS），予不同濃度自體富血小板的血漿培養(yǎng)液的條件干預(yù)，并進(jìn)行細(xì)胞的形態(tài)學(xué)、細(xì)胞的增殖以及細(xì)胞的成脂活性分析，報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料資料隨機(jī)選自無傳染病和內(nèi)分泌病的成人腹部和大腿脂肪的脂質(zhì)，予以酶消化方法進(jìn)行人脂肪來源干細(xì)胞提取，脂肪相關(guān)抽取物為50ml，抽取者的性別沒有限制，年齡20~49歲，平均年齡（32±6.34）歲。

1.2試劑和設(shè)備的選擇Gibco提供的胎牛的血清、DMEM的培養(yǎng)基和PBS，由美國(guó)的Molecular Probe lnc提供的DiI應(yīng)用液，Sigma提供的I型的膠原酶、胰蛋白酶、凝血酶和四氮唑的復(fù)合物(XTT)，Beckman提供的高速低溫的離心機(jī)，以及日本Rader提供的酶標(biāo)儀。

1.3方法將無傳染病和內(nèi)分泌病的成人腹部和大腿脂肪的脂質(zhì)，予酶消化方法進(jìn)行人脂肪來源干細(xì)胞提取，選擇二次離心方法進(jìn)行自體富血小板的血漿制備。把細(xì)胞分成研究組和對(duì)照組，研究組予以不同濃度自體富血小板的血漿培養(yǎng)液的條件干預(yù)，對(duì)照組無相關(guān)富血小板的血漿干預(yù)。采用XTT的比色方法進(jìn)行患者細(xì)胞增殖測(cè)定，采用油紅O染色方法進(jìn)行細(xì)胞成脂的活性測(cè)定[1]。

1.3.1脂肪來源干細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定選擇人吸脂術(shù)提取脂質(zhì)部分，37℃下應(yīng)用0.1%的膠原酶進(jìn)行40min的消化，混勻，等量體積完全培養(yǎng)基進(jìn)行中和離心后去上清，行細(xì)胞活性的染色檢測(cè)，加10%DMEM培養(yǎng)基，孵箱過夜。細(xì)胞生長(zhǎng)80%可傳代，選取第3代的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。選擇流式的細(xì)胞儀進(jìn)行表面抗原、多向誘導(dǎo)的分化等方法的脂肪來源干細(xì)胞鑒定。

1.3.2富血小板的血漿（PRP）制備和測(cè)定予以二次離心方法，靜脈采血20ml，離心7min，集上清液和交界面下2mm的液體，予以9min的二次離心，橙黃色下層是PRP。當(dāng)同人全血提取RPR的血小板數(shù)達(dá)或過全血4倍，表示達(dá)PRP實(shí)驗(yàn)要求。把PRP和凝血酶按9：l混勻，過夜后離心10min取上清液，除菌后冰箱保存等待備用。

1.3.3測(cè)定脂肪來源干細(xì)胞體外增殖予以四氮唑復(fù)合物(XTT)比色方法進(jìn)行細(xì)胞增殖確定，把ADSCS接種到96孔的培養(yǎng)板內(nèi)，PRP濃度分別是5%、10%和20%，其中未加PRP的ADSCS屬于陰性的對(duì)照組，每組4復(fù)孔。放在孵箱進(jìn)行24、48和72h的培養(yǎng)，注意細(xì)胞形態(tài)觀察。棄上清后加50L的LXTT-PMS的工作液，4h的繼續(xù)培養(yǎng)后進(jìn)行5min的振蕩，依據(jù)酶標(biāo)儀比色，并進(jìn)行吸光度相關(guān)OD值的測(cè)定。

1.3.4測(cè)定脂肪來源干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)提取ADSCS后進(jìn)行脂肪誘導(dǎo)相關(guān)DMEM的培養(yǎng)基更換。研究組加10%的PRP，完全對(duì)照組為成脂的誘導(dǎo)液，參照組含10%的胎牛血清完全的培養(yǎng)基。定期換液，并行1~2w的定向分化和誘導(dǎo)，應(yīng)用油紅O染色定性方法進(jìn)行體外誘導(dǎo)的分化觀察。染色后陽性細(xì)胞為紅色，肉眼及顯微鏡易證實(shí)，并進(jìn)行細(xì)胞的分化比例計(jì)算。

1.4觀察指標(biāo)觀察并統(tǒng)計(jì)分析細(xì)胞生長(zhǎng)的形態(tài)學(xué)、細(xì)胞的增殖以及細(xì)胞的成脂活性情況。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 18.0軟件包統(tǒng)計(jì)分析，一般資料應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，計(jì)量資料應(yīng)用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料應(yīng)用χ2檢驗(yàn)，當(dāng)P＜0.05，表示比較具統(tǒng)計(jì)學(xué)上的意義。

2結(jié)果

2.1脂肪來源干細(xì)胞的生長(zhǎng)經(jīng)過鑒定提取的PRP相關(guān)血小板的濃度達(dá)標(biāo)。研究組細(xì)胞的胞漿豐富、胞體豐滿，且密度比較大；分化誘導(dǎo)以后研究組脂滴細(xì)胞充滿，對(duì)照組少量的脂滴，參照組沒有脂滴梭形的細(xì)胞。

2.2 脂肪來源干細(xì)胞體外增殖當(dāng)增殖培養(yǎng)48h、72h下20%、10%和5%PRP研究組，和陰性的對(duì)照組比較OD值差異明顯（P＜0.05），且研究組各個(gè)組間的差異明顯（P＜0.05），其中10%PRP增殖最顯著。

2.3脂肪來源干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)研究組的10%PRP經(jīng)過1w成脂的分化誘導(dǎo)，分化的比例（45.9±6.3）%，對(duì)照組染色為陽性，分化比例（16.2±5.1）%，比較差異明顯具統(tǒng)計(jì)學(xué)上的意義（P＜0.05）。

3討論

富血小板的血漿（PRP）屬于自體的血小板濃縮體，可以釋放出多類高濃度生長(zhǎng)因子，例如，血小板的源性相關(guān)生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮的生長(zhǎng)因子等[2]。經(jīng)過大量臨床證實(shí)，富血小板的血漿（PRP）釋放的相關(guān)因子對(duì)脂肪細(xì)胞分化和組織生長(zhǎng)有促進(jìn)效果，但是，相關(guān)脂肪來源的肝細(xì)胞相關(guān)研究文獻(xiàn)比較少[3]。

本研究主要對(duì)體外培養(yǎng)人脂肪來源干細(xì)胞增殖及成脂分化應(yīng)用富血小板血漿的效果進(jìn)行觀察。研究得出研究組細(xì)胞胞體豐滿，密度比較大；且研究組和對(duì)照組比較OD值差異明顯，其中研究組10%PRP的增殖最顯著；同時(shí)研究組染色為陽性，分化比例（45.9±6.3）%，對(duì)照組分化（16.2±5.1）%，比較差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)上的意義。

綜上所述，對(duì)人脂肪來源干細(xì)胞體外培養(yǎng)，予以自體富血小板的血漿培養(yǎng)液的條件干預(yù)，能夠有效促進(jìn)細(xì)胞的增殖及成脂分化相關(guān)活性。

參考文獻(xiàn)：

[1]劉景蘭.ADSCs與PRP聯(lián)合脂肪顆粒移植對(duì)血運(yùn)重建的影響[J].中國(guó)美容整形外科雜志，2012，19(6):534-536.

[2]劉景蘭.兔ADSCs與PRP聯(lián)合對(duì)脂肪顆粒移植入裸鼠皮下后血運(yùn)重建的影響[D].大連醫(yī)科大學(xué)：外科學(xué)，2012.

[3]張?jiān)扑?富血小板血漿對(duì)體外培養(yǎng)人脂肪來源干細(xì)胞增殖及成脂分化的作用[D].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，24(3):185-187.

編輯/哈濤