過表達(dá)RI對膀胱癌移植瘤生長的影響

摘要：目的 探討過表達(dá)核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor，RI)基因?qū)Π螂装┞闶笠浦擦錾L及血管表達(dá)的影響。方法 實驗分三組：T24-RI細(xì)胞組（過表達(dá)RI的T24細(xì)胞細(xì)胞組)、T24vector組(轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒的T24細(xì)胞)、T24組(正常T24細(xì)胞)。將pcDNA3.1-RI、pcDNA3.1-分別轉(zhuǎn)染人膀胱癌T24細(xì)胞，篩選穩(wěn)定表達(dá)的T24細(xì)胞，將其注入裸鼠皮下，檢測裸鼠移植瘤的大小和質(zhì)量，HE染色觀察移植瘤組織的形態(tài)學(xué)變化，利用免疫組化技術(shù)檢測移植瘤組織中微血管的變化。結(jié)果 T24-RI組較T24 vector組與T24細(xì)胞未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組，瘤體質(zhì)量顯著降低（P＜0.01）。T24-RI組癌細(xì)胞較T24 vector組與未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組體積減小，T24-RI組微血管較T24 vector組與T24組明顯減少。結(jié)論 過表達(dá)人核糖核酸酶抑制因子基因RI，可以抑制膀胱癌裸鼠移植瘤的生長。

關(guān)鍵詞：核糖核酸酶抑制因子；膀胱癌；血管生成素；真核表達(dá)

人核糖核酸酶抑制因子是一個分子量為50kD的酸性蛋白，它具有7個亮氨酸殘疾重復(fù)片段組成的亮氨酸拉鏈（LRRs）結(jié)構(gòu)。RI的功能就是識別并結(jié)合核糖核酸酶A，從而抑制其活性。具有LRR重復(fù)結(jié)構(gòu)的一百多種蛋白顯示的包括DNA修復(fù)，細(xì)胞外基質(zhì)相互作用，周期調(diào)控，信號傳導(dǎo)在內(nèi)的多種生物學(xué)功能[1-4]。根據(jù)結(jié)構(gòu)基因組學(xué)，我們推斷RI具有我們尚未發(fā)現(xiàn)的其他生物學(xué)功能。本實驗通過構(gòu)建的過表達(dá)RI的載體，轉(zhuǎn)染并篩選穩(wěn)定表達(dá)的克隆。從動物體內(nèi)試驗探索RI基因的質(zhì)粒對人膀胱癌生長的影響及其可能存在的機(jī)制。

1材料與方法

1.1主要材料和試劑膀胱癌T24細(xì)胞，T24 vector細(xì)胞，T24-RI細(xì)胞均來自本實驗室保存：SPF級BALB/C裸鼠購于北京大學(xué)動物實驗中心，由重慶醫(yī)科大學(xué)動物中心代為飼養(yǎng)。

兔抗人RI一抗由本實驗保存；免疫組化染色試劑盒，BAD染液購于北京中衫金錢生物技術(shù)有限公司。

1.2裸鼠移植瘤模型的構(gòu)建立即將取下的瘤重一半放入液氮，一半放入4%多聚甲醛溶液中保存。抑制率=(1-實驗組瘤重/對照組瘤重)×100%；解剖裸鼠取肺部組織，放入4%多聚甲醛溶液中固定保存，用于HE染色觀察肺組織轉(zhuǎn)移情況。

1.3移植瘤肺組織，瘤組織HE染色 取4%多聚甲醛溶液固定的各組肺，瘤組織及人體膀胱癌組織，石蠟包埋，10μm切片。

1.4組織免疫熒光取液氮凍存的瘤組織，切片，冷丙酮固定，通透，BSA封閉，一抗CD31（1:100稀釋），4℃孵育過夜，PBS洗3遍，羊抗兔Dylight 488標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1:50）37℃避光孵育2h，PBS洗3遍，封片。于熒光顯微鏡下拍照。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理，數(shù)據(jù)以（x±s）表示，組間比較行方差分析及q檢驗。

2結(jié)果

2.1過表達(dá)RI對裸鼠移植瘤生長的影響T24組，T24 vector組，T24-RI組細(xì)胞注射裸鼠，35d后處死取瘤記重。T24組，T24 vector組，T24-RI組平均瘤重分別為（0.2727±0.073），（0.2635±0.164），（0.081833±0.062）。T24-RI組移植瘤的生長受到明顯抑制，同T24組，T24 vector組比較，抑制率分別為25.67% 和 37.85%。

圖1成功構(gòu)建裸鼠移植瘤

a 裸鼠移植瘤；b 裸鼠成瘤質(zhì)量分析

2.2組織免疫熒光觀察各組移植瘤血管的變化如圖2，CD31抗體在T24-RI組中弱陽性，在T24組，T24 vector組成強(qiáng)陽性，表明T24-RI組移植瘤中微血管的明顯少于T24組，T24 vector組。

圖2CD31檢測瘤組織微血管生成情況

2.3肺組織HE染色檢測各組癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移情況T24-RI組肺組織未見明顯轉(zhuǎn)移， T24組，T24 vector組在血管周圍均可見到細(xì)胞核增大，細(xì)胞核染色加深的細(xì)胞團(tuán)，表明癌細(xì)胞向肺組織轉(zhuǎn)移。

3討論

將T24，T24 vector，T24-RI三組細(xì)胞皮下注射裸鼠后，取形成的移植瘤稱重發(fā)現(xiàn)，T24-RI組瘤重明顯輕與其他兩對照組，HE染色結(jié)果顯示，兩對照組中細(xì)胞核染色加深，核質(zhì)比例加大，核分裂相增多，微血管明顯多于T24-RI組，說明RI基因在體內(nèi)抑制了癌細(xì)胞的增殖及微血管的發(fā)生從而抑制腫瘤的生長。

綜上所述，動物體內(nèi)實驗證明RI基因可以有效抑制血管生長，抑制腫瘤的生長。探索RI抑制血管的作用和機(jī)制，為進(jìn)一步闡明RI基因的功能，尋找新的腫瘤血管抑制靶基因和藥物提供科學(xué)依據(jù)和理論線索。

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編輯/哈濤