原發(fā)性肝癌組織MAGE-A1和MAGE-A3蛋白表達(dá)及其生物學(xué)意義的研究

摘要：本文采用免疫組化(SP)法檢測30例HCC患者癌組織及相應(yīng)癌旁組織中MAGE-A1，A3蛋白表達(dá)，并結(jié)合臨床資料進行分析。分析結(jié)果顯示MAGE-A1，A3在HCC中高表達(dá)，提示其在HCC的發(fā)生與發(fā)展中起了一定的作用，是肝癌免疫治療的可用靶向分子。

關(guān)鍵詞：肝癌，黑色素瘤抗原基因

腫瘤/睪丸抗原(cancer testis antigen，CTA)是一類腫瘤特異性抗原，因能夠引起機體對腫瘤的主動免疫[1]，成為腫瘤疫苗研究中的熱點。本研究以兩種免疫原性較強的CTA抗原黑色素瘤抗原基因(melanoma antigen， MAGE)A1和A3作為免疫標(biāo)志物，采用免疫組化(SP)法檢測其在原發(fā)性肝癌（HCC）組織中的表達(dá)情況，探討其作為肝癌免疫治療靶標(biāo)的可行性及其與肝癌生物學(xué)行為的關(guān)系。

1資料與方法

1.1一般資料選取2011年1月~2013年6月沈陽市第四人民醫(yī)院肝膽外科收治的HCC患者30例，伴有乙型肝炎病毒陽性26例。其中男女比例為2:3，年齡38~72歲，平均56.3歲。全部病例術(shù)前均無化療、放療及免疫治療史。均手術(shù)完整切除病灶，經(jīng)術(shù)后病理證實，切緣均陰性。病灶切除后，先距腫瘤邊緣5cm外取癌旁組織，再切取癌組織，保存于液氮中備用，然后轉(zhuǎn)-80℃凍存?zhèn)溆?。正常睪丸蠟塊標(biāo)本作為陽性對照。

1.2實驗試劑濃縮型鼠抗人MAGE-A1單克隆抗體、鼠抗人MAGE-A3單克隆抗體、鼠抗人AFP單克隆抗體均購自Upstate公司、SP試劑盒和DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物公司。

1.3方法 所有標(biāo)本經(jīng)10%的福爾馬林固定、脫水、石蠟包埋，4μm連續(xù)切片，分別作HE和SP染色。SP染色按試劑盒說明操作，3%雙氧水室溫孵育除去內(nèi)源性過氧化物酶的活性，微波修復(fù)抗原15min，常規(guī)免疫組化標(biāo)記。以正常睪丸組織作為陽性對照；用PBS代替一抗作陰性對照。DAB顯色，蘇木精襯染，中性樹膠封固，顯微鏡觀察。

1.4結(jié)果判斷及評分標(biāo)準(zhǔn) 光鏡雙盲法觀察切片中5個400倍高倍視野，細(xì)胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒判定為免疫組化陽性染色。采用半定量積分法[2]判斷結(jié)果: 1)陽性細(xì)胞數(shù)：≤5%為0分，>5%-25%為1分，>25%~50%為2分，>50%~75%為3分，>75%為4分；2)陽性強度：無色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。將兩者積分相乘，0分為陰性（-），1-4分為弱陽性（+），5-8分為陽性（++），9-12分為強陽性（+++）。為減少人為因素造成的誤差，以2位病理科醫(yī)生觀察結(jié)果核對后作為最終評定結(jié)果，若判定結(jié)果相差3分則重新觀察。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法使用SPSS10.0軟件建立數(shù)據(jù)庫，使用χ2檢驗和四格表確切概率法。

2結(jié)果

2.1 MAGE-A1，A3和AFP蛋白在HCC中的表達(dá)MAGE-A1，A3和AFP蛋白在正常肝癌組織中無表達(dá)，陽性表達(dá)于肝癌的細(xì)胞質(zhì)。見圖1。

圖1 分別為MAGE-A1，A3和AFP蛋白在肝癌的細(xì)胞質(zhì)的表達(dá)(×200)

2.2MAGE-A1，A3和AFP蛋白在HCC中的聯(lián)合表達(dá)情況30例HCC患者癌組織中MAGE-A1，A3和AFP蛋白表達(dá)的陽性率分別為40%、47%和63%，高于對照組（0%）(P<0.01)。30例HCC中，至少表達(dá)1種MAGE蛋白的為21例，表達(dá)率為70%；表達(dá)2種MAGE蛋白的為10例，表達(dá)率為33%，29例HCC患者至少表達(dá)1種蛋白，表達(dá)率為96.7%。MAGE-A1/AFP蛋白陽性表達(dá)的為10例，表達(dá)率為33.3%。MAGE-A3/AFP蛋白陽性表達(dá)13例，表達(dá)率為43.3%。MAGE-A1，A3/AFP蛋白陽性表達(dá)8例，表達(dá)率為26.7%。

2.3MAGE 蛋白表達(dá)與臨床指標(biāo)的關(guān)系30例HCC中MAGE-A1，A3蛋白表達(dá)的陽性率與患者性別、年齡、有無包膜以及乙型肝炎病毒感染等指標(biāo)無關(guān)(P>0.05)，與腫瘤大小及AFP水平相關(guān)(P<0.05)。

3討論

目前，肝癌的治療仍以手術(shù)切除結(jié)合放、化療為主，術(shù)后常見轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)，因此，針對腫瘤特異性抗原的免疫治療已成為臨床治療研究的熱點。CTA已經(jīng)被認(rèn)為是目前免疫原性最強的腫瘤抗原之一。

國內(nèi)外研究多采用RT-PCR的方法檢測CTA基因的表達(dá)，蛋白水平的研究尚不多。本研究顯示，30例HCC患者癌組織中MAGE-A1，A3蛋白均有較高表達(dá)，70%至少表達(dá)1種MAGE蛋白。聯(lián)合AFP檢測后，96.7%的HCC患者至少表達(dá)1種蛋白，遠(yuǎn)高于單一檢測AFP的表達(dá)率。對比臨床資料發(fā)現(xiàn)MAGE-A1，A3蛋白表達(dá)與患者年齡、性別、病毒感染和有無完整包膜等均不相關(guān)，而MAGE- A1，A3蛋白表達(dá)與患者腫瘤大小及AFP水平均存在相關(guān)性，這就提示我們檢測血清中MAGE-A1，A3蛋白特異性抗體的表達(dá)，就有可能作為HCC的輔助診斷指標(biāo)之一，尤其是在AFP陰性表達(dá)的HCC患者中有可能作為腫瘤標(biāo)志物。

綜上所述，MAGE-A1和A3在肝癌中的高水平表達(dá)，為進一步研究MAGE在肝癌的分子診斷和免疫靶向治療提供了依據(jù)。

參考文獻：

[1]Scanlan MJ，Gure A O，Jnnghlnth A A，et al.Cancer/ testis antigens:an expanding family of targets for cancer immunotherapy[J].Immunological Reviews，2002，188:22-32.

[2]Clark E A，Brugge J S.Integrins and signals transduction pathways:the road taken[J].Science，1995，268(2):233-239.

編輯/王海靜