兒童急性再生障礙性貧血TNF-α\\IL-12的變化

摘要：目的 為兒童急性再生障礙性貧血體內(nèi)細(xì)胞因子濃度變化提供證據(jù)。方法 采再障組（42例）和對(duì)照組（40例）靜脈血，用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定所取血樣標(biāo)本中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-12（IL-12）的含量。分析兩組外周血中兩種細(xì)胞因子是否存在顯著性差異。結(jié)果 再障組患兒外周血TNF-α和IL-122的含量均高于對(duì)照組兒童。結(jié)論通過對(duì)TNF-α和INF-γ的監(jiān)測(cè)，可以了解再障患兒疾病現(xiàn)狀，治療效果和預(yù)后情況。

關(guān)鍵詞：再生障礙性貧血；腫瘤壞死因子-α；白細(xì)胞介素-12

急性再生障礙性貧血在病程中伴有內(nèi)臟出血、重癥感染，常危及生命，預(yù)后欠佳。但是現(xiàn)在大部分的病例被診斷為特發(fā)性免疫異常導(dǎo)致的再生障礙性[1]。細(xì)胞因子失調(diào)，包括腫瘤壞死因子（TNF-α），白細(xì)胞介素-12（IL-12），研究發(fā)現(xiàn)在再生障礙性貧血的發(fā)病機(jī)制中起到了重要的作用[2]。兒童再生障礙性貧血已經(jīng)成為繼兒童白血病之后，兒童死亡率較高的一種血液系統(tǒng)疾病[3]。本次研究為了給臨床上提供更好的關(guān)于兒童急性再障體內(nèi)細(xì)胞因子濃度變化的證據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料 2010年6月~2013年6月， 42例再生障礙性貧血患兒，符合我國小兒再生障礙性貧血的診斷及分型標(biāo)準(zhǔn)[4]?；純壕鶠榧毙栽偕系K性貧血發(fā)作。其中男20例，女42例，中位年齡6.4（3～14）歲。對(duì)照組選取我院體檢中心正常兒童，共40例，男21例，女19例，中位年齡7.1（2～15）歲。兩組兒童的年齡比較和性別比例上無顯著性差異，P≥0.05。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本收集用肝素鈉抗凝管采集患者和對(duì)照組兒童的靜脈血5ml用于TNF-α，另5ml用于IL-12的測(cè)定。

1.2.2TNF-α含量的測(cè)定以鼠源性的抗TNF-α單抗以每孔400ng的量，在PH值為9的碳酸-碳酸鈉緩沖液中包被96孔板中，置4℃環(huán)境過夜。取出后洗滌3次，加入預(yù)先備好的待測(cè)樣本及標(biāo)準(zhǔn)的TNF-α(制作標(biāo)準(zhǔn)曲線用)。37℃孵育2h。用洗滌液洗滌3次，加入羊抗鼠TNF-α抗體，37℃孵育2h后，再洗滌3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊IgG，37℃孵育2h后加入底物顯色。終止顯色后在自動(dòng)酶標(biāo)儀上測(cè)定濃度，并以標(biāo)準(zhǔn)曲線為基準(zhǔn)求得TNF-α的含量。以Mean±SD ng/ml的形式表示結(jié)果。

1.2.3IL-12含量測(cè)定采用雙抗體夾心ELISA 測(cè)定。每個(gè)樣本全血以1000 r /min，離心10 min，吸取1mL 血漿置于－40°C 冰箱保存，集中測(cè)試，操作步驟參照ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行，基本步驟與測(cè)量干擾素的過程相同，結(jié)果由自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定，并以并以標(biāo)準(zhǔn)曲線為基準(zhǔn)求得IL-12的含量。以Mean±SD ng/ml的形式表示結(jié)果。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS1 12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均x±s表示，結(jié)果分析采用獨(dú)立樣本的t 檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有顯著性。

2結(jié)果

2.1外周血TNF-α含量的對(duì)比結(jié)果再障組患兒外周血中TNF-α含量的平均值是：56.51±20.02 ng/ml，而對(duì)照組的患兒的平均值為（25.88±10.11） ng/ml。通過獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，P=0.008＜0.05，差異具有顯著性。

2.2外周血IL-12含量的對(duì)比結(jié)果通過獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析得到結(jié)果為，再障組患兒外周中的IL-12平均含量與對(duì)照組患兒外周血中的平均含量的差異具有顯著性，P=0.012＜0.05。再障組患兒IL-12含量平均為：（32.54±16.06）pg/ml，對(duì)照組患兒外周血中IL-12含量平均為：（20.02±4.40）pg/ml。

3討論

近年來，已經(jīng)有不少學(xué)者從細(xì)胞因子水平方面研究再生障礙性貧血［5］。到目前為止雖然再生障礙性貧血精確的發(fā)病機(jī)制還沒有被完全的闡明，但是大量證據(jù)表明Ｔ細(xì)胞介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)異常在再障的發(fā)病機(jī)理中發(fā)揮了重要的作用。Th1功能失調(diào)被認(rèn)為是再障發(fā)病的一個(gè)重要原因，Th1功能活躍導(dǎo)致TNF-α和INF-γ過表達(dá)成為了再障炎癥改變的基礎(chǔ)[6]。

腫瘤壞死因子，是單核-巨噬細(xì)胞分泌的單核細(xì)胞刺激因子，在炎癥和免疫反應(yīng)中起著重要的作用。人的TNF具有兩種形式TNF-α和TNF-β。由于TNF-β又稱為淋巴毒素只限于局限分泌，而TNF-α則被廣泛分泌到外周血循環(huán)中。所以在關(guān)于機(jī)體免疫功能的研究中，一般都是檢測(cè)TNF-α的含量。研究表明，再障患者體內(nèi)TNF的含量有明顯增加[7]。最初的研究認(rèn)為，TNF是造血祖細(xì)胞的負(fù)調(diào)節(jié)因子，能夠抑制粒紅細(xì)胞集落形成單位、粒單細(xì)胞集落形成單位、紅系爆式集落形成單位及紅系集落形成單位的形成[8]。但后期證實(shí)，TNF對(duì)正常造血細(xì)胞具有雙向調(diào)節(jié)作用[9]。在正常情況下，TNF-α濃度較低，適量的TNF-α對(duì)機(jī)體有保護(hù)作用，在疾病的病理改變下，TNF-α大量分泌，以致對(duì)機(jī)體產(chǎn)生損害作用。最近的研究證實(shí)，TNF升高是由于患兒存在自身免疫功能缺陷，特別是組織免疫受到抑制，過量的TNF-α刺激單核-巨噬細(xì)胞從而分泌更多的結(jié)果。是否還有其它因素影響，尚待進(jìn)一步探討[10]。本研究結(jié)果為再障兒童體內(nèi)外周血TNF-α含量顯著高于正常兒童含量提供了臨床依據(jù)。

IL-12是啟動(dòng)Th1細(xì)胞的重要因子。而IL-12協(xié)同其他的細(xì)胞因子組成的細(xì)胞因子網(wǎng)可以決定機(jī)體免疫應(yīng)答的類型。本次研究的結(jié)果顯示再障患兒外周血IL-12的含量明顯高于對(duì)照組正常兒童的含量。提示IL-12在再生障礙性貧血的發(fā)生、發(fā)展的過程中具有一定的作用。已經(jīng)有研究證實(shí)，IL-12可以誘導(dǎo)Th1細(xì)胞分泌INF-γ[11]。所以在再障患兒的診斷和治療的過程中，關(guān)注IL-2可以有效的了解再障的病情進(jìn)展。但是本次研究只是做了再障患兒與正常兒童IL-2的差別的研究，并沒有研究IL-2含量的高低與病情嚴(yán)重程度的關(guān)系。要得到這方面的結(jié)果，需在今后的研究中進(jìn)行急慢性再障患兒細(xì)胞因子的對(duì)比和相關(guān)性研究。

綜上所述，在再生障礙貧血的發(fā)展過程中，通過對(duì)TNF-α和IL-12兩種細(xì)胞因子的監(jiān)測(cè)，可以有效地了解疾病的現(xiàn)狀、治療效果和預(yù)后，具有較重要的意義。本研究為再障的新治療 提供較新的研究思路，有助于進(jìn)一步研究兒童再生障礙性貧血。

參考文獻(xiàn)：

[1]Jianping Li，Qinjun Zhao，Wen Xinget al.Terleukin-27 enhances the production of tumour necrosis actor-a and interferon-c by bone marrow T lymphocytes in aplastic anaemia[J].British Journal of Haematology，2011，153:764-772.

[2]Hara，T.Ando，K.Tsurumi H. Moriwaki H.Excessive production of tumor necrosis factor-alpha by bone marrow T lymphocytes is essential in causing bone marrow failure in patients with aplastic anemia[J].European Journal of Haematology，2004，73:10-16.

[3]劉亞平.兒童再生障礙性貧血242例實(shí)驗(yàn)室診斷及臨床分析[J]..吉林醫(yī)學(xué)，2009，5:855-856.

[4]中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)血液學(xué)組，中華兒科雜志編輯委員會(huì).小兒再生障礙性貧血的診療建議.中華兒科雜志，2001，39:422-423.

[5]柴憶歡，朱玲琍.再生障礙性貧血與細(xì)胞因子[J].國外醫(yī)學(xué)兒科學(xué)分冊(cè)，1995，22(4):178-180.

[6]Hoeve M.A.De Boer T.Langenberg D.M.Sanal O.Verreck F.A. Ottenhoff T.H.IL-12 receptor deficiency revisited:IL-23-mediated signaling is also impaired in human genetic IL-12 receptor beta1 deficiency[J].European Journal of Immunology 2003，33:3393-3397.

[7]Shinohara K.Increased production of tumor necrosis factor-alpha by peripheral blood mononuclear cells in the patients with aplastic anemia[J].Am J Hematol，1999，37:75.

[8]Pcetr C.Effects of recombinant TNF on proliferation and differentiation of leukemic and normal hemopoietic cells in vitro[J].J Clin invest，1986，78:1694.

[9]Caux C，Sealand S，F(xiàn)avre C et al.TNF-2 strongly potentiates IL-3 and GM-CSF-Induceel proliferation of human CD HPC[J].Blood，1990，75:2292.

[10]馮越.再生障礙性貧血患兒血清TNF-α、INF-γ和T細(xì)胞亞群檢測(cè)的臨床意義[J].放射免疫學(xué)雜志，2008，21(6):511-512.

[11]Trinchieri G.Interleukin-12 and the regulation of innate resistance and adaptive immunity.Nature Reviews[J].Immunology，2003，3:133-146.