體外培養(yǎng)人脂肪來源干細胞增殖及成脂分化應用富血小板血漿的效果分析

摘要：本文通過探究體外培養(yǎng)人脂肪來源干細胞增殖及成脂分化應用富血小板血漿的效果觀察。所選資料隨機選自無傳染病和內(nèi)分泌病的成人腹部和大腿脂肪的脂質(zhì)提取的人脂肪來源干細胞，把細胞分成研究組和對照組，研究組予以不同濃度自體富血小板的血漿培養(yǎng)液的條件干預，對照組未予以富血小板的血漿培養(yǎng)液，分析細胞的形態(tài)學、細胞的增殖以及細胞的成脂活性。通過分析研究組細胞胞漿豐富、胞體豐滿，密度比較大；研究組和對照組培養(yǎng)增殖OD值差異明顯（P＜0.05），其中研究組10%PRP增殖最顯著；同時研究組染色分化比例（45.9±6.3）%，對照組分化比例（16.2±5.1）%，比較差異具統(tǒng)計學上的意義（P＜0.05）。認為對人脂肪來源干細胞體外培養(yǎng)，予自體富血小板的血漿培養(yǎng)液的條件干預，能有效促進細胞的增殖及成脂分化相關活性，具有一定臨床應用和研究價值。

關鍵詞：人脂肪來源干細胞；成脂分化；富血小板血漿

本文主要對無傳染病和內(nèi)分泌病的成人腹部和大腿脂肪的脂質(zhì)提取的人脂肪來源干細胞（ADSCS），予不同濃度自體富血小板的血漿培養(yǎng)液的條件干預，并進行細胞的形態(tài)學、細胞的增殖以及細胞的成脂活性分析，報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料資料隨機選自無傳染病和內(nèi)分泌病的成人腹部和大腿脂肪的脂質(zhì)，予以酶消化方法進行人脂肪來源干細胞提取，脂肪相關抽取物為50ml，抽取者的性別沒有限制，年齡20~49歲，平均年齡（32±6.34）歲。

1.2試劑和設備的選擇Gibco提供的胎牛的血清、DMEM的培養(yǎng)基和PBS，由美國的Molecular Probe lnc提供的DiI應用液，Sigma提供的I型的膠原酶、胰蛋白酶、凝血酶和四氮唑的復合物(XTT)，Beckman提供的高速低溫的離心機，以及日本Rader提供的酶標儀。

1.3方法將無傳染病和內(nèi)分泌病的成人腹部和大腿脂肪的脂質(zhì)，予酶消化方法進行人脂肪來源干細胞提取，選擇二次離心方法進行自體富血小板的血漿制備。把細胞分成研究組和對照組，研究組予以不同濃度自體富血小板的血漿培養(yǎng)液的條件干預，對照組無相關富血小板的血漿干預。采用XTT的比色方法進行患者細胞增殖測定，采用油紅O染色方法進行細胞成脂的活性測定[1]。

1.3.1脂肪來源干細胞的培養(yǎng)和鑒定選擇人吸脂術提取脂質(zhì)部分，37℃下應用0.1%的膠原酶進行40min的消化，混勻，等量體積完全培養(yǎng)基進行中和離心后去上清，行細胞活性的染色檢測，加10%DMEM培養(yǎng)基，孵箱過夜。細胞生長80%可傳代，選取第3代的細胞實驗。選擇流式的細胞儀進行表面抗原、多向誘導的分化等方法的脂肪來源干細胞鑒定。

1.3.2富血小板的血漿（PRP）制備和測定予以二次離心方法，靜脈采血20ml，離心7min，集上清液和交界面下2mm的液體，予以9min的二次離心，橙黃色下層是PRP。當同人全血提取RPR的血小板數(shù)達或過全血4倍，表示達PRP實驗要求。把PRP和凝血酶按9：l混勻，過夜后離心10min取上清液，除菌后冰箱保存等待備用。

1.3.3測定脂肪來源干細胞體外增殖予以四氮唑復合物(XTT)比色方法進行細胞增殖確定，把ADSCS接種到96孔的培養(yǎng)板內(nèi)，PRP濃度分別是5%、10%和20%，其中未加PRP的ADSCS屬于陰性的對照組，每組4復孔。放在孵箱進行24、48和72h的培養(yǎng)，注意細胞形態(tài)觀察。棄上清后加50L的LXTT-PMS的工作液，4h的繼續(xù)培養(yǎng)后進行5min的振蕩，依據(jù)酶標儀比色，并進行吸光度相關OD值的測定。

1.3.4測定脂肪來源干細胞成脂誘導提取ADSCS后進行脂肪誘導相關DMEM的培養(yǎng)基更換。研究組加10%的PRP，完全對照組為成脂的誘導液，參照組含10%的胎牛血清完全的培養(yǎng)基。定期換液，并行1~2w的定向分化和誘導，應用油紅O染色定性方法進行體外誘導的分化觀察。染色后陽性細胞為紅色，肉眼及顯微鏡易證實，并進行細胞的分化比例計算。

1.4觀察指標觀察并統(tǒng)計分析細胞生長的形態(tài)學、細胞的增殖以及細胞的成脂活性情況。

1.5統(tǒng)計學分析數(shù)據(jù)應用SPSS 18.0軟件包統(tǒng)計分析，一般資料應用標準差（x±s）表示，計量資料應用t檢驗，計數(shù)資料應用χ2檢驗，當P＜0.05，表示比較具統(tǒng)計學上的意義。

2結果

2.1脂肪來源干細胞的生長經(jīng)過鑒定提取的PRP相關血小板的濃度達標。研究組細胞的胞漿豐富、胞體豐滿，且密度比較大；分化誘導以后研究組脂滴細胞充滿，對照組少量的脂滴，參照組沒有脂滴梭形的細胞。

2.2 脂肪來源干細胞體外增殖當增殖培養(yǎng)48h、72h下20%、10%和5%PRP研究組，和陰性的對照組比較OD值差異明顯（P＜0.05），且研究組各個組間的差異明顯（P＜0.05），其中10%PRP增殖最顯著。

2.3脂肪來源干細胞成脂誘導研究組的10%PRP經(jīng)過1w成脂的分化誘導，分化的比例（45.9±6.3）%，對照組染色為陽性，分化比例（16.2±5.1）%，比較差異明顯具統(tǒng)計學上的意義（P＜0.05）。

3討論

富血小板的血漿（PRP）屬于自體的血小板濃縮體，可以釋放出多類高濃度生長因子，例如，血小板的源性相關生長因子、血管內(nèi)皮的生長因子等[2]。經(jīng)過大量臨床證實，富血小板的血漿（PRP）釋放的相關因子對脂肪細胞分化和組織生長有促進效果，但是，相關脂肪來源的肝細胞相關研究文獻比較少[3]。

本研究主要對體外培養(yǎng)人脂肪來源干細胞增殖及成脂分化應用富血小板血漿的效果進行觀察。研究得出研究組細胞胞體豐滿，密度比較大；且研究組和對照組比較OD值差異明顯，其中研究組10%PRP的增殖最顯著；同時研究組染色為陽性，分化比例（45.9±6.3）%，對照組分化（16.2±5.1）%，比較差異具統(tǒng)計學上的意義。

綜上所述，對人脂肪來源干細胞體外培養(yǎng)，予以自體富血小板的血漿培養(yǎng)液的條件干預，能夠有效促進細胞的增殖及成脂分化相關活性。

參考文獻：

[1]劉景蘭.ADSCs與PRP聯(lián)合脂肪顆粒移植對血運重建的影響[J].中國美容整形外科雜志，2012，19(6):534-536.

[2]劉景蘭.兔ADSCs與PRP聯(lián)合對脂肪顆粒移植入裸鼠皮下后血運重建的影響[D].大連醫(yī)科大學：外科學，2012.

[3]張云松.富血小板血漿對體外培養(yǎng)人脂肪來源干細胞增殖及成脂分化的作用[D].南方醫(yī)科大學學報，2011，24(3):185-187.

編輯/哈濤