半乳甘露聚糖檢測用于侵襲性曲霉菌早期感染診斷的研究

摘要：目的 評價酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測半乳甘露聚糖（GM）抗原在侵襲性曲霉菌（IA）早期感染診斷和療效監(jiān)測中的臨床價值。方法 以62例呼吸內(nèi)科、重癥醫(yī)學(xué)科及血液內(nèi)科造血干細胞移植（HSCT）患者為研究對象，針對患者連續(xù)檢測，共檢測標本188份。采用ELISA法測定患者血清中GM含量，測定濃度可達0.5ng/ml。同時對所選病例進行G實驗檢測和真菌培養(yǎng)，所得結(jié)果與GM結(jié)果聯(lián)合分析。結(jié)果 以1.0為陽性界值，GM檢測的敏感性為53.8%，特異性100%，診斷符合率88.7%；以0.5為陽性界值，敏感性為84.6%，特異性96.7%，診斷符合率95.2%。G實驗顯示以GM0.5為陽性界值GM陽性患者血漿（1-3）-β-D-葡聚糖含量為（68.58±12.76）pg/ml，GM陰性患者血漿（1-3）-β-D-葡聚糖含量為（3.18±1.25）pg/ml，兩組數(shù)據(jù)經(jīng)t-檢驗比較具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。GM檢測可早于真菌培養(yǎng)方法9d預(yù)測曲霉感染。曲霉菌感染患者GM的連續(xù)監(jiān)測顯示抗曲霉菌治療前GM水平保持在較高水平，抗真菌治療有效患者的GM含量呈下降趨勢，無效死亡患者仍保持較高水平。結(jié)論 血清GM檢測是侵襲性曲霉菌早期感染診斷和療效監(jiān)測的有用指標，與G實驗聯(lián)合應(yīng)用判斷效果更好。

關(guān)鍵詞：半乳甘露聚糖；曲霉菌；早期感染

近年來侵襲性曲霉菌感染（IA）發(fā)病率逐漸增多，已經(jīng)成為免疫功能低下患者致死率高的主要原因。有報道稱在造血干細胞移植（HSCT）患者中IA的發(fā)病率為2%～26%，實體器官移植患者中的發(fā)病率為1%～15%，死亡率可達到74%～92%。在中性粒細胞減少的患者（抗腫瘤治療后）和使用免疫抑制劑（干細胞移植、器官移植特別是骨髓抑制）或皮質(zhì)類固醇的患者，患者一旦發(fā)生曲霉菌感染，死亡率高達50%～90%。研究開發(fā)早期、快速、準確的診斷方法對疾病的預(yù)后具有決定性的意義。半乳甘露聚糖（GM）是曲霉菌絲壁上的熱穩(wěn)定多糖抗原，有一個非免疫原性甘露聚糖核心和含半乳呋喃糖基的免疫反應(yīng)性側(cè)鏈。其半乳糖殘基具有抗原性，目前檢測該成分快速診斷曲霉菌病受到廣泛關(guān)注，被稱為最有前景的檢測曲霉菌感染的血清學(xué)方法。

1資料與方法

1.1一般資料 取自2012年1月～12月皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院呼吸內(nèi)科、重癥醫(yī)學(xué)科、血液內(nèi)科住院患者送檢的血液、肺泡灌洗液等標本62例。實驗組32例，其中男20例，女12例，入選實驗組均符合以下標準：發(fā)熱（T>37.5℃），經(jīng)廣譜抗生素治療4d后無效；長期中性粒細胞減少；胸部影像學(xué)檢查出現(xiàn)新發(fā)病灶或出現(xiàn)肺部感染癥狀。對照組30例，其中男19例，女11例，為相應(yīng)科室同時期住院患者，均無深部真菌感染臨床癥狀。

1.2診斷標準 IA分3類：第1類確診IA，第2類高度懷疑IA（也稱臨床診斷），第3類可疑IA，診斷標準均符合歐洲癌癥治療組織真菌病研究組（EORTC/MSG）制訂的IA診斷標準[5]。

1.3樣本采集 患者每3～4d用真空采血管采靜脈血3ml，采血后48h內(nèi)完成檢測。連續(xù)檢測GM抗原直到治療后癥狀和體征好轉(zhuǎn)、體溫下降至正常后2w，或患者死亡，或排除IA診斷為止。32例實驗組共檢測血清樣本128份，30例對照組檢測樣本60份。所有患者還同時進行影像學(xué)檢查，痰或血的病原菌培養(yǎng)，部分患者收集支氣管肺泡灌洗液進行培養(yǎng)及肺活檢進行組織培養(yǎng)或病理學(xué)檢查。

1.4 GM檢測方法 法國BIO-RAD公司的曲霉菌酶免檢測試劑盒（PlateliaTM Aspergillus EIA）簡述如下：分別加300μl被測血清或（質(zhì)控物）到每個1.5ml聚丙烯試管，每個試管加100μl血清處理液，用力混合或震蕩以徹底混勻試管，100℃水浴3min，10000g離心10min，上清液用來檢測GM抗原。每個孔中加50μl酶結(jié)合物，然后加50μl處理過的血清標本上清液或質(zhì)控物，封板37℃干燥孵育90min，洗滌5遍，每孔迅速加200μl底物顯色劑，避光室溫下孵育30min，每孔中加入100μl終止液，波長為450nm下測試每孔的吸光度（A值）。每次實驗cut-off值均值必須在0.3～0.8之間，陽性對照/cut-off值均值大于2，陰性對照值/cut-off值均值小于0.4作為實驗內(nèi)質(zhì)控。2次連續(xù)采集樣本均為陽性或者同一份標本連續(xù)兩次檢測均為陽性才能判斷該實驗結(jié)果為曲霉菌感染陽性。將IA剛開始治療時所測得的GM光密度與含1ngGM標準品所測得的光密度的比值（GM指數(shù)GMI）作為基礎(chǔ)值。在第7d治療結(jié)束時采血樣測得的GMI與基礎(chǔ)GMI相比較，當增加1.0時，被認為治療失敗。在第14d治療結(jié)束時采血樣測得的GMI與基礎(chǔ)GMI相比較，當增加1.0，被認為治療失敗。

1.5 G實驗檢測方法 真空采血管取靜脈血3ml后，混勻，3000r/min離心1min得富含血小板血漿，分離出血漿在10min內(nèi)使用，取上述富含血小板血漿0.1ml加入裝有0.9ml樣品處理液中輕輕混勻后，70℃保溫10min，取出后立刻放入冷水浴中3min冷卻至30℃以下，即為待測血漿樣品，取待測血漿樣品0.2ml加入反應(yīng)主劑中，輕輕混勻20s待完全溶解后用微量加樣器轉(zhuǎn)移至10×65mm無熱原平底反應(yīng)管中，立刻插入MB-80微生物快速動態(tài)檢測系統(tǒng)中進行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后自動計算含量。

2結(jié)果

2.1不同界值時血清GM的結(jié)果及敏感性和特異性 患者血清的GM值計算公式為 被檢血清A 值/cut-off均值A(chǔ)值。如果以GM值1.0為陽性界值判斷標準，0.8

2.2 GM實驗陽性與G實驗結(jié)果 以GM值0.5為陽性界值，GM陽性患者血漿（1-3）-β-D-葡聚糖含量為（68.58±12.76）pg/ml，GM陰性患者血漿（1-3）-β-D-葡聚糖含量為（3.18±1.25）pg/ml，兩組比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.3連續(xù)監(jiān)測GM值與療效的關(guān)系 GM檢測同時對患者進行標本接種培養(yǎng)，結(jié)果顯示GM檢測陽性可早于真菌培養(yǎng)方法9天預(yù)測曲霉感染，且對13例GM陽性患者進行抗曲霉菌治療，9例有效，4例無效死亡。每3～4d采集患者靜脈血進行GM值測定，連續(xù)14d，發(fā)現(xiàn)4例治療無效死亡患者的血清GM值居高不下或進行性升高，9例治療有效患者的血清GM值呈現(xiàn)下降趨勢。

3討論

侵襲性真菌感染是指侵襲性深部組織和內(nèi)部以及全身的真菌感染，包括深部組織感染和真菌血癥。近20年來，由于大劑量廣譜抗生素、抗腫瘤藥物及免疫抑制劑的長期應(yīng)用，各種導(dǎo)管在體內(nèi)的介入以及惡性腫瘤艾滋病等免疫功能低下患者的不斷增加。侵襲性真菌感染的發(fā)病率明顯上升，在醫(yī)院感染中占有重要地位，日益成為患者死亡的重要原因之一[5]。侵襲性真菌感染臨床診斷比較困難，臨床表現(xiàn)可因感染部位不同、臨床癥狀體征不具有特異性，而不易與細菌感染相區(qū)別。目前GM診斷IA還存在著患者因素、實驗標準、標本因素等問題，因此需要針對不同科室的患者群以及標本類型等統(tǒng)一實驗條件，選取合適的OD值及陽性界值，使各實驗室之間具有可比性。該實驗選取了呼吸內(nèi)科、重癥醫(yī)學(xué)科、血液內(nèi)科的標本，但未詳細區(qū)分標本類型是血液還是肺泡灌洗液，且收集標本量較少，這在今后的實驗過程中需加以改進和豐富標本量?？傊?，GM檢測IA具有早期、快速、敏感性高、特異性高、診斷符合率高等特點，有待于在臨床實驗室廣泛開展，在臨床診斷IA時需綜合臨床癥狀體征及其他診斷措施，達到早期診斷、早期治療、降低病死率目的。

參考文獻：

[1]Yilmaz Turay U，Yildrim Z，Turkoz Y，et al.Use of pleural fluid C reactive protein in diagnosis of pleural of effusion[J].Respir Med，2000，94（5）：432.

[2]Anthiong PCY，Shiu SC，Tak WL，et al.Thoracoscopic management of malignant pleural effusions[J].Chest，1996，109：1234-1236.

[3]曾治平，羅江洪.侵襲性肺部真菌感染實驗室診斷研究進展[J].中國老年學(xué)雜志，2010，30（16）：2391-2393.

編輯/申磊