食品中金黃色葡萄球菌定量檢測方法比較研究

摘 要：采用Baird-Parker平板涂布法、Baird-Parker傾注法及Petrifilm測試紙片法，對含一定濃度的金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌液進(jìn)行計(jì)數(shù)，并對食品中的金黃色葡萄球菌進(jìn)行檢驗(yàn)。結(jié)果表明，三種方法的檢測結(jié)果有較好的一致性，且傾注法和紙片法操作簡單、結(jié)果穩(wěn)定、再現(xiàn)性好；此外，紙片法在檢測簡便性、準(zhǔn)確性和檢測時(shí)間等方面的比較中優(yōu)于傾注法，綜合多方面因素考慮，紙片法在相關(guān)行業(yè)的日常檢測中值得推廣應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：金黃色葡萄球菌；涂布法；傾注法；紙片法

中圖分類號： TB 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：16723198（2014）17019702

0 引言

隨著人們?nèi)找嬖鲩L的生活需求，食品質(zhì)量和安全問題備受大家關(guān)注。而金黃色葡萄球菌作為一種引起人類和動(dòng)物化膿感染的重要致病菌和造成人類食物中毒的常見致病菌，已被列為我國食品衛(wèi)生微生物常規(guī)檢測項(xiàng)目之一。食品中金黃色葡萄球菌的定量檢測方法多采用Baird-Parker法，其作為檢測金黃色葡萄球菌的傳統(tǒng)方法已使用多年，且廣為大家所接受，但其操作較繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力。近年來，為了縮短檢測時(shí)間、簡化檢測程序，國內(nèi)外很多機(jī)構(gòu)研究了一些新的方法，美國3M公司研制的紙片法就是其中一種被諸多國際權(quán)威組織認(rèn)證的標(biāo)準(zhǔn)化測試方法。此外，還可利用平板傾注法與鑒別培養(yǎng)基Baird-Parke培養(yǎng)基結(jié)合的方法，對金黃色葡萄球菌活菌進(jìn)行快速檢測。本實(shí)驗(yàn)對Baird-Parker平板涂布法、Baird-Parker傾注法及Petrifilm測試紙片法檢測金黃色葡萄球菌進(jìn)行比較，旨在探求一種適應(yīng)微生物實(shí)驗(yàn)室要求的快速檢測方法，為今后的食品快速檢測方法的研究及應(yīng)用積累經(jīng)驗(yàn)。

1 料與方法

1.1 材料與儀器

樣品：熟肉制品、水產(chǎn)品、糕點(diǎn)采集自本市若干市場和超市，各10種。

菌株：金黃色葡萄球菌ATCC25923購置于北京陸橋技術(shù)責(zé)任有限公司。

儀器：Hfsafe-1500TE型生物安全柜，上海力申科學(xué)儀器有限公司；LABPower-I型紅外接種環(huán)滅菌器，廣州海太光電生物科技有限公司；WX-80A型旋渦混合器，上海精科實(shí)業(yè)有限公司；DNP-9172型電熱恒溫培養(yǎng)箱；XSP-2CA型光學(xué)顯微鏡，上海光學(xué)儀器五廠；LC10063038型拍擊式均質(zhì)器，iMiX公司。

試劑：7.5%氯化鈉肉湯、Baird-Parke瓊脂培養(yǎng)基及配套試劑（亞碲酸鉀卵黃液）、腦心浸出液肉湯（BHI）、凍干兔血漿，由北京陸橋技術(shù)責(zé)任有限公司生產(chǎn)；Petrifilm金黃色葡萄球菌快速檢驗(yàn)測試片，由美國3M公司生產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)菌液的制備

將標(biāo)準(zhǔn)菌株金黃色葡萄球菌ATCC25923接種于7.5%氯化鈉肉湯進(jìn)行增菌，36℃培養(yǎng)24h；將增菌液劃線接種于Baird-Parke瓊脂平板上，36℃培養(yǎng)45h-48h；挑取1-2個(gè)菌落用滅菌生理鹽水制成菌濃大約為1.0×108CFU/mL的菌懸液。

1.2.2 培養(yǎng)基準(zhǔn)備

將Baird-Parke瓊脂培養(yǎng)基按說明進(jìn)行配制，滅菌，制作成平板。同時(shí)部分培養(yǎng)基42℃水浴備用。

1.2.3 Baird-Parker平板涂布法

Baird-Parker平板涂布法按GB 4789.10-2010中第二法進(jìn)行。

1.2.4 Baird-Parker傾注法

無菌條件下，制備10倍系列稀釋樣品勻液，選擇2個(gè)至3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液，每個(gè)稀釋度分別吸取1mL于培養(yǎng)皿中央，然后再加入Baird-Parker培養(yǎng)基，快速混勻，培養(yǎng)基凝固后，倒置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)；36℃士1℃培養(yǎng)45h-48h，觀察結(jié)果。典型菌落形態(tài)及鑒定參照GB 4789.10-2010。

1.2.5 Petrifilm測試紙片法

選擇2個(gè)至3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液，每個(gè)稀釋度接種兩張測試片。將測試片置于平坦的實(shí)驗(yàn)臺面上，揭開上層膜，吸取1mL樣液滴于紙片的中央，將上層膜緩慢蓋下，避免氣泡產(chǎn)生，將壓板放置在上層膜中央處，輕輕摁壓使樣液均勻覆蓋于圓形的培養(yǎng)面積上，拿起壓板，靜置至少1min使培養(yǎng)基凝固。將測試片的透明面朝上置于培養(yǎng)箱內(nèi)，36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h。若測試片上無菌落或均為暗紫紅色菌落，則測試結(jié)束；若測試片上出現(xiàn)除典型紫紅色以外顏色的菌落，如黑色、藍(lán)綠色等，則需使用確認(rèn)片作進(jìn)一步確認(rèn)。

1.2.6 實(shí)驗(yàn)方法

（1）分別用以上三種方法對標(biāo)準(zhǔn)菌液濃度重復(fù)性進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

（2）分別用以上三種方法對食品中的金黃色葡萄球菌進(jìn)行檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 三種方法對金黃色葡萄球菌的計(jì)數(shù)

三種方法對金黃色葡萄球菌的計(jì)數(shù)結(jié)果如表1所示。

表1 不同方法測得的金黃色葡萄球菌計(jì)數(shù)

結(jié)果比較（×106CFU/mL）

利用t檢驗(yàn)法對三種方法測定結(jié)果兩兩比較分析，結(jié)果如下：

tAB=dABsdAB n=34/101299-352/1010-1/10 =0.968

tAC=dACsdACn=63/101493-632/1010-1/10 =1.805

tBC=dBCsdBCn=28/10466-282/1010-1/10=1.349

從t值表查得t0.05=2.262，故tABt0.05，PAC>0.05，PBC>t0.05，說明涂布法、傾注法和紙片法測得的結(jié)果無顯著差異，三種方法測得的結(jié)果比較接近；而涂布法的離散度為10.8，傾注法的離散度為5.5，紙片法的離散度為3.8，說明紙片法測得的結(jié)果精密度、再現(xiàn)性最好，傾注法次之，涂布法最差。

2.2 食品中金黃色葡萄球菌檢出結(jié)果比較，如表2所示。

表2 三種檢測方法的金黃色葡萄球菌檢出結(jié)果

由表2可知，紙片法的檢出率最高，為50%；涂布法和傾注法的檢出率比紙片法低，均為30%。而不同類別的產(chǎn)品檢出率也有所不同，被檢測樣品中水產(chǎn)品的檢出率最高，涂布法、傾注法和紙片法的檢出率分別為20%、20%和30%；熟肉制品的檢出率次之，分別為10%、10%和20%；糕點(diǎn)中金黃色葡萄球菌均未檢出，檢出率為0。究其原因，可能與產(chǎn)品的生產(chǎn)加工、包裝運(yùn)輸及銷售環(huán)境等因素有關(guān)。

2.3 三種方法檢測金黃色葡萄球菌的各項(xiàng)指標(biāo)比較

三種方法檢測金黃色葡萄球菌的各項(xiàng)指標(biāo)比較如表3所示。

表3 三種方法檢測金黃色葡萄球菌的各項(xiàng)指標(biāo)比較

注：*表示程度。

由表3可知，對于簡便性和工作量，涂布法和傾注法都包括培養(yǎng)48h后對典型菌落做兔血漿凝固酶的實(shí)驗(yàn)，操作相當(dāng)繁瑣，同時(shí)也加大了工作量；而紙片法由于其培養(yǎng)基系統(tǒng)是預(yù)先制備好的，省去了大量繁瑣的準(zhǔn)備工作，且紙片法對疑似菌落的確認(rèn)只需加確認(rèn)反應(yīng)培養(yǎng)1h-3h即可得出結(jié)果，與其他兩種方法相比工作量最少，操作使用最方便。對于檢測時(shí)間，涂布法和傾注法從接種培養(yǎng)到典型菌落的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)耗時(shí)78h；而紙片法從接種培養(yǎng)到對可疑菌落的確認(rèn)培養(yǎng)只需27h左右，大大地減少了檢測時(shí)間。對于計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性，涂布法和傾注法受人員操作熟練程度影響較大；而紙片法的操作更為標(biāo)準(zhǔn)化，人為誤差較小。對于檢測成本，涂布法和傾注法的成本相當(dāng)，而紙片法的成本則要高出許多。

3 結(jié)論

采用Baird-Parker平板涂布法、Baird-Parker傾注法及Petrifilm測試紙片法對含一定濃度的金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌液進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果表明，三種方法測得的結(jié)果無明顯差異，具有較好的一致性；而且紙片法測得的結(jié)果穩(wěn)定、再現(xiàn)性最好，傾注法次之，涂布法最差。通過對食品中的金黃色葡萄球菌進(jìn)行檢驗(yàn)，可知紙片法的檢出率最高，涂布法和傾注法的檢出率比紙片法低。此外，對這三種方法的其他指標(biāo)進(jìn)行比較，可知紙片法在簡便性、工作量、檢測時(shí)間、計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性等方面都優(yōu)于其他兩種方法，但是由于所用的測試紙片是進(jìn)口的，使得紙片法的成本比其他兩種方法高出許多，從而在某種程度上制約了其應(yīng)用。

雖然紙片法的成本高，但是金黃色葡萄球菌的檢測結(jié)果與傳統(tǒng)的Baird-Parker平板涂布法無顯著差異，且大大縮短了檢測時(shí)間；操作簡便，大大降低了傳統(tǒng)檢測方法的操作繁瑣性及實(shí)驗(yàn)時(shí)的工作量。所以紙片法在金黃色葡萄球菌定量檢測中具有優(yōu)勢，可作為食品中金黃色葡萄球菌快速檢測的方法，建議其在檢測部門、工廠企業(yè)等相關(guān)行業(yè)得到廣泛的應(yīng)用。

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