以核苷酸為原料保健食品中核苷酸的含量測定

【摘要】目的：建立以核苷酸為原料保健食品中核苷酸含量測定的方法。方法：采用定磷法[1] [2]測定以核苷酸為保健食品原料的保健食品中核苷酸的含量測定。結果：核苷酸在2.5ug～15μg/ml范圍內線性關系良好，r≥0.9995;回收率結果在98.6%-101.9%，RSD為1.29%（n=9）;。結論：定磷法簡單、靈敏、快速、準確，適用于以核苷酸為原料保健食品中核苷酸含量測定的方法。

【關鍵詞】核苷酸 保健食品 定磷法

Abstract：Objective：To establish a method to determine the total content of nucleotide contained in health food made with nucleotide as raw material.Methods：Total content of nucleotide contained in the health food were determined by Phosphorus determination method. Results： The content of nucleotide showed good linear relationship over the range of 2.5-15μg/ml （r=0.9999）.The recovery was 98.6-101.9% with RSD being 1.29%（n=9）.Conclusion：The phosphorus determination method is simple，sensitive，rapid，accurate and suitable for total content determination of nucleotide in health food made with nucleotide as raw material.

Keywords：nucleotide;Health food;Phosphorus determination method

【中圖分類號】R4 " "【文獻標識碼】A " "【文章編號】1671-8801（2014）011- 0011-03

核苷酸是核苷與磷酸通過磷酸酯鍵結合構成，糖環(huán)上的所有游離羥基（核糖的C-2、C-3、C-5）均能與磷酸發(fā)生酯化結合。生物體內核苷酸多是5’-核苷酸;此外細胞中存在具有重要代謝功能的多磷酸核苷酸。用于保健食品原料中的核苷酸為單磷酸核苷酸。

目前，國內外的核苷酸檢測方法主要有高效液相色譜法、紫外法、定磷法、毛細管電泳法。美國食品化學品法典：FCC8中收錄的核苷酸的檢測方法，其中CMP、UMP、AMP用高效液相方法，而GMP、IMP用紫外方法。國家輕工行業(yè)標準核苷酸檢測GMP采用紫外法，因此針對不同的核苷酸應該用不同的檢測方法。

核苷酸為含有機磷[2]化合物，用濃硫酸將核苷酸中的磷轉變?yōu)闊o機磷，在酸性條件下與定磷試劑反應生成磷鉬酸銨，用還原劑還原成深藍色鉬藍，在660nm[1]波長處測定其吸收值，用標準曲線法得有機磷含量，計算得核苷酸的含量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

DZKW電熱恒溫水浴鍋（北京永光明醫(yī)療儀器廠）;HM-200分析天平（萬分之一）（日本AND公司）;AG135分析天平（十萬分之一）（METTLER TOLEDO）;UV-2450紫外分光光度計（SHIMADZU）;TU-1901紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）;SP-1900UV紫外分光光度計（上海光譜儀器有限公司）;Agilent 1260液相色譜儀-泵（安捷倫）;Agilent 1260DAD檢測器（安捷倫）;Agilent B.04.02化學工作站（安捷倫）。

1.2 試劑

鉬酸銨（分析純）（批號：20100518，天津市化學試劑四廠（凱達化工廠））;抗壞血酸（分析純）（批號：20130307，天津市科密歐化學試劑有限公司）;硫酸（分析純）（批號：20111109，丹東市龍海試劑廠）硫酸二氫鉀（分析純）（批號：20130830，天津市大茂化學試劑廠）;硫酸銅（分析純）（批號：20120206，天津市科密歐化學試劑有限公司）;硫酸鉀（分析純）（批號：20100701，天津市科密歐化學試劑有限公司）;過氧化氫（分析純）（批號：20120227，天津市科密歐化學試劑有限公司）;甲醇（色譜純）（批號：1627507209，Merck KGaA）;磷酸（分析純）（批號：20110218，沈陽市聯(lián)邦試劑廠）。

1.3 保健食品

珍奧?核諾膠囊（珍奧集團股份有限公司，批號：20130302）

2 方法

2.1 "磷標準曲線的制備

取標準磷溶液（5μg/mL）0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL，用水補足到3.0mL，含磷量分別為0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0μg，加定磷試劑3.0mL后搖勻，于45℃水浴中放置20分鐘，于660nm波長處測定吸收度（A660），以含磷量為橫坐標，以A660為縱坐標繪制標準曲線。

2.2 "供試品中總磷量的測定

2.2.1 "精密稱?。ɑ蛄咳。┕┰嚻愤m量（約含2.5-5mg核苷酸），置于消化瓶中，加入濃硫酸10mL及催化劑50mg，在消化爐上加熱至發(fā)白煙，樣品由黑色變成淡黃色，取下稍冷，加數滴30%過氧化氫液，繼續(xù)加熱至溶液呈無色至淡藍色為止，冷至室溫，用純化水稀釋到50mL，與樣品消化的同時做空白對照，空白瓶中不加樣品，用水代替，其他完全相同。（根據供試品含量可適當調整取樣量及消化方式，最終制成約含核苷酸100μg/ml的消化液）

2.2.2 "取消化液1.0ml，加水2.0ml，定磷試劑3.0ml，搖勻，于45℃水浴中放置20分鐘，于660nm波長處測定吸收度（A660）。空白對照同樣操作。

2.3 "供試品中無機磷含量測定

另取供試品適量，用水稀釋到50ml，取1.0ml，加水2.0ml，定磷試劑3.0ml，搖勻，于45℃水浴中放置20分鐘，于660nm波長處測定吸收度（A660）。

2.4 "結果計算

首先制作標準磷曲線，以5.2項中消化和5.3項中未消化的供試品溶液測得的A660 從標準曲線上查出總磷和無機磷的量，按式計算供試品中核苷酸的含量：

3 結果

3.1 線性和范圍

3.1.1測定方法：取標準磷溶液（5μg/mL）0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5， 3.0mL，用水補足到

3.0mL，含磷量分別為0，2.5，5.0，7.5，10，12.5，15.0μg，加定磷試劑3.0mL后搖勻，于45℃水浴中放置20分鐘，于660nm波長處測定吸光度（A660），0點為空白，以含磷量（μg） 為橫坐標，以吸光度值（A660）為縱坐標繪制標準曲線。

3.1.2 標準曲線繪制：

標準曲線

3.1.3 單項結論：標準曲線為Y=0.04998X+0.00382，相關系數r=0.9999。

3.2 精密度

3.2.1 重復性

3.2.1.1對照測定：精密吸取6組標準磷溶液（5μg/mL）各1.0mL用水補足到3.0mL，加定磷試劑3.0mL后搖勻，于45℃水浴中放置20分鐘，于660nm波長處測定吸光度（A660）。結果見表2。

3.2.1.2 供試品的測定：供試品為珍奧核諾膠囊（批號：20130302，理論含量：33.6%）;稱取供試品15mg，置于消化瓶中，加入10mL濃硫酸及50mg催化劑，在消化爐上加熱至發(fā)白煙，樣品由黑色變成淡黃色，取下稍冷，加數滴30%過氧化氫液，繼續(xù)加熱至溶液呈無色至淡藍色為止，冷至室溫，用純化水定容到50mL，與樣品消化的同時做空白對照，空白瓶中不加樣品，用水代替，其他完全相同。取消化液1.0ml，加水2.0ml，定磷試劑3.0ml，搖勻，于45℃水浴中放置20分鐘，于660nm波長處測定吸收度（A660），空白對照同樣操作，測定總磷含量;另取供試品15mg，用水定容到50ml，取1.0ml，加水2.0ml，定磷試劑3.0ml，搖勻，于45℃水浴中放置20分鐘，于660nm波長處測定吸收度（A660），測定無機磷含量，根據公式計算出供試品核苷酸的含量。結果見表3

3.2.1.3 單項結論：以上測定結果的RSD值分別為0.40%、0.49%.

3.2.2中間精密度

3.2.2.1 供試品的測定：3名分析人員用不同儀器對供試品進行測定，供試品為珍奧核諾膠囊（批號：20130302，理論含量：33.6%）;稱取供試品15mg，置于消化瓶中，加入10mL濃硫酸及50mg催化劑，在消化爐上加熱至發(fā)白煙，樣品由黑色變成淡黃色，取下稍冷，加數滴30%過氧化氫液，繼續(xù)加熱至溶液呈無色至淡藍色為止，冷至室溫，用純化水定容到50mL，與樣品消化的同時做空白對照，空白瓶中不加樣品，用水代替，其他完全相同。取消化液1.0ml，加水2.0ml，定磷試劑3.0ml，搖勻，于45℃水浴中放置20分鐘，于660nm波長處測定吸收度（A660），空白對照同樣操作，測定總磷含量;另取供試品15mg，用水定容到50ml，取1.0ml，加水2.0ml，定磷試劑3.0ml，搖勻，于45℃水浴中放置20分鐘，于660nm波長處測定吸收度（A660），測定無機磷含量，根據公式計算出供試品核苷酸的含量。結果見表4

3.2.2.2 標準曲線：

（1）Y=0.04899X+0.00260 "相關系數r為0.9997

（2）Y=0.05017X-0.00140 "相關系數r為0.9998

（3）Y=0.05073X-0.00854 "相關系數r為0.9999

3.2.2.3 實驗結果

3.2.2.4 單項結論：測定結果的RSD值為0.40%。

3.3 準確度

3.3.1加樣回收率：精密稱取9份供試品各15mg，分為低、中、高3組，每組3個樣品，分別往各組供試品中加入含400μg、500μg、600μg的標準磷儲備液置于消化瓶中，加入10mL濃硫酸及50mg催化劑，在消化爐上加熱至發(fā)白煙，樣品由黑色變成淡黃色，取下稍冷，加數滴30%過氧化氫液，繼續(xù)加熱至溶液呈無色至淡藍色為止，冷至室溫，用純化水定容到100mL，與樣品消化的同時做空白對照，空白瓶中不加樣品，用水代替，其他完全相同。取消化液1.0ml，加水2.0ml，定磷試劑3.0ml，搖勻，于45℃水浴中放置20分鐘，于660nm波長處測定吸收度（A660），空白對照同樣操作，測定總磷含量;另取供試品15mg，用水定容到50ml，取1.0ml，加水2.0ml，定磷試劑3.0ml，搖勻，于45℃水浴中放置20分鐘，于660nm波長處測定吸收度（A660），測定無機磷含量，根據公式計算出供試品核苷酸的含量。結果見表4（供試品磷含量μg=15mg×33.45%×1000÷11÷100）

3.3.2 單項結論：回收率結果在98.6%-101.9%，RSD=1.29%

3.4 對比實驗

3.4.1 方法

方法一：保健食品中核苷酸的測定方法（2003）;

方法二：本方法（定磷法）。

3.4.2 對比結果

3.4.2.1 供試品

供試品：珍奧核諾膠囊（批號：20130302），理論含量：33.6%。

3.4.2.2 實驗數據

4 討論

試驗結果證明所建立的定磷法簡單、靈敏、快速、準確，適用于以核苷酸為原料保健食品中核苷酸含量測定的方法。但由于本方法通過測定有機磷來推算核苷酸的含量，因此當配方中含其他有機磷化合物時，本方法不適用，存在局限性。

參考文獻：

[1] 抗壞血酸一鉬藍顯色定磷法檢測轉移因子制劑中核苷酸的含量， 宋紅波，黑龍江醫(yī)藥Heilongjiang Medicine Journal Vo1.22 No.2 2009;

[2] 分光光度法測定有機磷的研究，王春林，廣州化學;

[3] 寡核苷酸類藥物磷的定性定量分析，李保山，CHINA MEDICINE AND PHARMACY，2013年4月第3卷第8。