Colo205來源大腸癌始動細(xì)胞分轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)分析

【摘要】目的 獲得大腸癌始動細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達(dá)變化譜，其細(xì)胞生物學(xué)特性研究提供依據(jù)。方法 "采用無血清懸浮培養(yǎng)、CD133抗體標(biāo)記磁珠分選Colo205不同細(xì)胞群，體外分化實驗及裸鼠成瘤實驗鑒定細(xì)胞特性，表達(dá)譜測序分析轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達(dá)變化。結(jié)果：3種細(xì)胞群中有14種癌癥轉(zhuǎn)移相關(guān)基因發(fā)生顯著地表達(dá)改變。 結(jié)論：無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)合CD133磁珠分選Colo205細(xì)胞獲得的CD133+細(xì)胞亞群具備大腸癌干細(xì)胞的基本特征且有14種轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達(dá)發(fā)生顯著改變，可用于后續(xù)生物學(xué)特性研究。

【關(guān)鍵詞】始動細(xì)胞;大腸癌;表達(dá)譜測序;轉(zhuǎn)移基因

Abstract： Objective To obtain differential genes for research of colorectal cancer initiating cells biological behavior. Methods Initiating cells were sorted by by CD133 microbead kit and RNA-seq was employed for analysis of differential genes. Results Expression levels of 14 metastatic genes were changed on the levels of mRNA. Conclusion Colorectal cancer initiating cells were obtained and expression of 14 metastatic genes has been changed on the level of mRNA.

Keywords： Colorectal cancer; initiating cell; metastatic genes; RNA-seq.

【中圖分類號】R4 " "【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A " "【文章編號】1671-8801（2014）011- 0001-02

大腸癌（colorectal cancer）是目前國內(nèi)發(fā)病率次僅于肺癌、乳腺癌的嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤，近年來結(jié)腸癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1，2]。一般認(rèn)為大腸癌發(fā)病機制與環(huán)境、遺傳、大腸腺瘤以及慢性大腸炎癥有關(guān)的涉及多個癌基因激活和抑癌基因失活漸變過程[3，4]。 腫瘤干細(xì)胞理論認(rèn)為癌癥難以治愈的一個重要原因是腫瘤中具有干細(xì)胞（Stem Cell）性質(zhì)的癌細(xì)胞即腫瘤始動細(xì)胞（Cancer initiating cell）的存在 [5]。 大腸癌干細(xì)胞是消化道惡性腫瘤中第一個被發(fā)現(xiàn)的癌癥始動細(xì)胞，分選并鑒定不同來源的腸癌始動細(xì)胞對于其后續(xù)的生物學(xué)特性分析、大腸癌診斷及綜合防治措施的制定等具有極為重要的意義[6]。本研究通過CD133+

標(biāo)記的免疫磁珠分選大腸癌始動細(xì)胞，利用體外分化實驗和裸鼠成瘤實驗對分選的大腸癌始動細(xì)胞的干細(xì)胞特性進(jìn)行鑒定和驗證，并用RNA-seq研究了腸癌轉(zhuǎn)移基因表達(dá)變化，共有14個大腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因的表達(dá)水平發(fā)生改變?？蔀槟[瘤分類與分型的基因標(biāo)記物以及藥物治療潛在靶點的發(fā)現(xiàn)，深入理解大腸癌腫瘤的發(fā)生機制，以及大腸癌的臨床治療提供依據(jù)。

1. 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株與動物 "人大腸癌colo205細(xì)胞株購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫; 4周齡BABL/ c雄裸鼠購自第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院動物中心，9只，體重20-25g，飼養(yǎng)于遵義醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)與生物研究中心SPF動物飼養(yǎng)房。

1.1.2 主要試劑TRIzol?、 B27添加劑（B27）及實驗所需生長因子購自Invitrogen公司;二甲基亞砜（DMSO）、胰蛋白酶粉購自Sigma公司;培養(yǎng)基及血清購自Gibco公司; CD 133細(xì)胞分選試劑盒 "（CDl33 Cell Isolation Kit） 購自Miltenyi公司。常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)等無酶耗材均購自杭州愛思進(jìn)公司。無血清培養(yǎng)基（serum free medium，SFM）為本實驗新鮮配制（98ml DMEM/F12培養(yǎng)基含2.0ml B27，0.2μg bFGF， 0.2μg LIF，0.2μg EGF， 加超純水定容到100ml，過濾滅菌，- 20℃保存，備用）。表達(dá)譜測序全套試劑購自Illumina公司。

1.2 方法

1.2.1 Colo205始動細(xì)胞分選 "取對數(shù)增長期Colo205細(xì)胞，以105/ mL的細(xì)胞密度接種至SFM中培養(yǎng);每2～ 3d加入2ml SFM培養(yǎng)基換液;10d后用酶消化法及機械分離法將colo205干細(xì)胞球分離成單細(xì)胞懸液后傳代。將形態(tài)穩(wěn)定的colo205干細(xì)胞單細(xì)胞懸液加入100μl FcR blocking及100μl CD133免疫磁珠， 4℃孵化30min;分選 Buffer洗滌細(xì)胞，800rpm、離心10min，棄上清。分選Buffer重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液過柱，收集CD133-細(xì)胞，用500μl分選 和CD133+陽性細(xì)胞。

1.2.2體外分化及裸鼠成瘤試驗

將分選所得CD133+與CD133-細(xì)胞密度調(diào)整至105/ml接種SFM培養(yǎng)，每2-3天加入2ml SFM培養(yǎng)基。10d天后向SFM中加入胎牛血清（SFM與胎牛血清的體積比為9：1），繼續(xù)培養(yǎng)。將分選得到CD133+、CD133-細(xì)胞及未分選的colo205細(xì)胞分別用生理鹽水稀釋，以1×103、1×104、1×105細(xì)胞數(shù)量分別將CD133+、CD133-細(xì)胞及未分選的colo205細(xì)胞接種至同一只babl/ c裸鼠左右腋下和右側(cè)腹股溝后飼養(yǎng)于SPF級動物房，觀察腫瘤生長情況并拍照。

1.2.3 "RNA-seq及生物學(xué)信息學(xué)分析

用TRIzol?總RNA提取試劑盒提取5g以上的總RNA（OD260/OD280≈1.9～2.0），利用Dynabeads? mRNA試劑盒利用磁珠法分離純化mRNA后樣品委托上海美吉生物技術(shù)公司進(jìn)行高通量測序文庫的構(gòu)建及數(shù)據(jù)處理。CD133+組/Colo205組/CD133-等3組樣品間兩兩樣品的轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量變化差異顯著，以Plt;0.05和qlt;0.05和表達(dá)變化差異為-2和2倍為差異表達(dá)基因篩選標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.4 差異基因定量PCR驗證 "為了進(jìn)一步驗證表達(dá)譜測序獲得基因表達(dá)變化數(shù)據(jù)的可靠性，我們隨機選取了p53和BCL11A基因，并以?-actin基因作為內(nèi)參，進(jìn)行表達(dá)變化的定量PCR驗證。P53F，5-′ CCCTCCTCAGCATCTTATCCG-3′; P53R， 5-′CAACCT CAGGCGGCTCATAG-3′;BCL11AF "5-′GACAGGGTGCTGCGGT TGA -3′，BCL11AR 5-′ GGCTTGCTACCTGGCTGGAA -3′;?-actin 引物：?-actin F 5-′ TGGCACCCAGCCAATGAA-3′， ?-actin R 5-′ CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′。定量PCR反應(yīng)條件為：95℃ 預(yù)變性2mim，40個熱循環(huán)擴(kuò)增（95℃變性 10s ， 60℃ 退火擴(kuò)增 20s），獲得Ct值，以2-△△Ct法進(jìn)行表達(dá)變化分析。

2. 結(jié)果與分析

2.1 大腸癌始動細(xì)胞體外分化及成瘤能力 "大腸癌Colo205細(xì)胞SFM培養(yǎng)基培養(yǎng)1d內(nèi)可見大部分細(xì)胞貼壁，隨傳代次數(shù)增多，細(xì)胞團(tuán)趨于球型。CD133+細(xì)胞培養(yǎng)1d后，細(xì)胞成團(tuán)并懸浮生長，4d可見典型腫瘤細(xì)胞球出現(xiàn)，加入胎牛血清， CDl33+細(xì)胞形態(tài)與之前在SSM培養(yǎng)基中的Colo205 細(xì)胞相同（圖1. D），CDl33-細(xì)胞則始終未見腫瘤細(xì)胞球生成。

不同細(xì)胞群細(xì)胞接種裸鼠，S第15天見105個CD133+細(xì)胞接種處開始見腫瘤生長，瘤體迅速增大;第20天104個CD133+細(xì)胞接種處見腫瘤生長;接種第30天103個CD133+細(xì)胞接種處見腫瘤生長;接種第35天105個colo205細(xì)胞接種處見腫瘤生長;第40天104個和103個colo205細(xì)胞及CD133-細(xì)胞接種處未見腫瘤生長。到42天觀察期結(jié)束，僅需接種103個CD133+細(xì)胞就可以在裸鼠皮下形成腫瘤，所有CD133+細(xì)胞接種處均成瘤;而colo205細(xì)胞需接種105個才能在第35天形成腫瘤，共有2只裸鼠成瘤;所有CD133-細(xì)胞接種處均未見腫瘤生長（圖2）。CD133+細(xì)胞內(nèi)成瘤能力強于CD133-細(xì)胞及colo205細(xì)胞，有明顯差異，Plt;0.05;而CD133-及colo205細(xì)胞間成瘤能力無明顯差異。

2.2 大腸癌Colo205來源細(xì)胞群轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達(dá)變化

依據(jù)所有樣本與參考基因組比對的結(jié)果，以FDRlt;0.05為顯著差異基因/轉(zhuǎn)錄本篩選條件，利用分析軟件Tophat及Cuffdiff分別轉(zhuǎn)錄本測序常規(guī)數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明本次測序所有樣品的FPKM分布差異不顯著。

將Illumina平臺測得CD133+、CD133-與未分選細(xì)胞基因序列與人參考基因?qū)Ρ群蠓謩e得到12915738、16118258及19304605條序列。依據(jù)這些序列計算每個基因在三種細(xì)胞中的FPKM值，以該值作為基因在該細(xì)胞中的表達(dá)量，3種細(xì)胞癌癥轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行差異顯著性分析發(fā)現(xiàn)：CD133+細(xì)胞與未分選的colo205細(xì)胞相比，有9個基因表達(dá)明顯上調(diào)，3個基因表達(dá)明顯下調(diào)，2個基因表達(dá)變化不大;CD133-細(xì)胞與未分選的colo205細(xì)胞比較的有10個基因表達(dá)明顯上調(diào)，4個基因表達(dá)明顯下調(diào)。CD133+細(xì)胞較CD133-細(xì)胞差異表達(dá)基因中有2個基因表達(dá)明顯上調(diào)，個基因表達(dá)明顯下調(diào)，10個基因表達(dá)變化不大。

3. 討論

磁珠分選腫瘤干細(xì)胞最重要的是確定腫瘤干細(xì)胞的表面標(biāo)志物，目前運用于大腸癌干細(xì)胞的標(biāo)志物有CDl33、CDl66[16]、CD44[17]等。其中CDl33最具有爭議性。比如O’Brien [5]等研究顯示：在大腸癌細(xì)胞中成瘤的細(xì)胞均為CD133+，但不是所有的CD133+細(xì)胞都可能導(dǎo)致腫瘤的生成，由此認(rèn)為不是所有的CD133+細(xì)胞都是大腸癌干細(xì)胞。雖然目前對CD133做為大腸癌的表面標(biāo)志物，必須結(jié)合細(xì)胞亞群做成瘤性鑒定[5-11]，如成瘤能力強的細(xì)胞亞群能夠能在無血清培養(yǎng)基中成球生長并增殖，且形成的腫瘤細(xì)胞球能在血清誘導(dǎo)下則貼壁分化，并能在在裸鼠體內(nèi)形成腫瘤[12-17]。

為了篩選與大腸癌診斷密切且相關(guān)的基因，本研究對裸鼠成立驗證的磁珠篩選的colo205來源的不同細(xì)胞群進(jìn)行表達(dá)譜測序分析，并利用定量PCR技術(shù)對隨機選取的兩個鋅指蛋白表達(dá)進(jìn)行驗證，結(jié)果這兩個基因的表達(dá)變化趨勢與表達(dá)譜測序結(jié)果一致（如基因p53 在CD133+/ CDl33-分別為2.366和1.61，在colo205/ CDl33-分別為2.17和1.6;基因BCL11A在CD133+/ CDl33-分別為2.951067和2.25012，在CD133+/colo205分別為0.149702和0.25174）。

本文用無血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)法聯(lián)合CD133磁珠分選法能獲得不同Colo205來源細(xì)胞群經(jīng)過裸鼠成瘤實驗及體外分化實驗鑒定表明CD133+細(xì)胞具大腸癌干細(xì)胞自我更新、分化及裸鼠成瘤特性，說明無血清培養(yǎng)法聯(lián)合磁珠分選法是分離、純化大腸癌始動細(xì)胞是一種行之有效的方法。我們用RNA-seq研究了腸癌轉(zhuǎn)移基因表達(dá)變化，共有14個大腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因的表達(dá)水平發(fā)生改變，可為腫瘤分類與分型的基因標(biāo)記物以及藥物治療潛在靶點的發(fā)現(xiàn)，深入理解大腸癌腫瘤的發(fā)生機制，以及大腸癌的臨床治療提供依據(jù)。

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