肉桂醛與鹽酸小檗堿聯(lián)合氟康唑抗白念珠菌效果體外實(shí)驗(yàn)分析

【摘要】目的：研究肉桂醛與鹽酸小檗堿單獨(dú)使用，以及聯(lián)合氟康唑抗白念球菌的作用影響與機(jī)制。方法：采取體外藥物敏感試驗(yàn)方法，檢測(cè)肉桂醛與鹽酸小檗堿單獨(dú)使用以及聯(lián)合氟康唑?qū)Π啄钋蚓目咕钚裕荒z分析軟件分析其藥物對(duì)白念球菌PLB1基因的mRNA表達(dá)影響【1】。結(jié)果：肉桂醛與鹽酸小檗堿單獨(dú)使用時(shí)，其對(duì)白念球菌具有明顯的抑制生長(zhǎng)作用；聯(lián)合氯康唑作用時(shí)，均具有協(xié)同作用；藥物處理的白念球菌PLB1的mRNA表達(dá)水平有明顯差異，聯(lián)合使用時(shí)比單獨(dú)使用時(shí)其表達(dá)水平明顯降低。結(jié)論：肉桂醛、鹽酸小檗堿與氯康唑都具有明顯的抗白念球菌作用，當(dāng)藥物聯(lián)合時(shí)，白念球菌的PLB1基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯低于藥物單獨(dú)使用

【關(guān)鍵詞】體外實(shí)驗(yàn)；肉桂醛；鹽酸小檗堿；氯康唑；白念球菌

【中圖分類(lèi)號(hào)】R-0 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B 【文章編號(hào)】1671-8801（2014）02-0332-02

近些年，隨著抗菌藥物和激素在臨床上的大量應(yīng)用，真菌感染率持續(xù)升高，其中白念球菌是院內(nèi)感染的主要致病菌之一【2】。氟康唑是目前國(guó)內(nèi)治療白念球菌感染的常用藥物，由于在臨床上長(zhǎng)期的應(yīng)用，耐藥菌株不斷產(chǎn)生，白念球菌對(duì)氟康唑的耐藥問(wèn)題日漸凸顯【3】。研究表明，中藥中大量結(jié)構(gòu)新穎、藥理活性強(qiáng)的化合物，在抗真菌感染中具有一定優(yōu)勢(shì)。目前，聯(lián)合應(yīng)用抗菌藥物來(lái)避免耐藥性產(chǎn)生的減少藥物副作用是治療真菌感染的研究方向之一。本次研究將通過(guò)探討肉桂醛、鹽酸小檗堿和氯康唑單獨(dú)及聯(lián)合抗白念球菌的作用及機(jī)制，為臨床上應(yīng)用中藥及中、西藥物聯(lián)合治療白念球菌感染提供初步試驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 藥液配制

1.2 菌液配置

取-800C凍存的白念球菌ATCC10231菌種100μL菌液，滴于SDA培養(yǎng)基上，用涂玻棒，將菌液均勻鋪于培養(yǎng)基。370C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)10min后，將培養(yǎng)皿倒置并繼續(xù)培養(yǎng)24h。連續(xù)畫(huà)線(xiàn)接種于新培養(yǎng)基上，370C培養(yǎng)24h。直徑>1mm的菌液（5個(gè)單菌落）置于生理鹽水中，用RP-MI1640培養(yǎng)基稀釋菌濃度：5×104CFU/mL。

1.3 3 種藥物的藥敏試驗(yàn)

參照美國(guó)臨床與實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)的真菌藥物敏感性試驗(yàn)方案的微量稀釋法步驟操作：將肉桂醛、鹽酸小檗堿、氯康唑分別用RP-MI1640培養(yǎng)基倍比稀釋。加入96孔板中，每孔100μL藥液+100μL含菌培養(yǎng)液。同時(shí)設(shè)立對(duì)照組。每次實(shí)驗(yàn)，均設(shè)立一組質(zhì)控菌。經(jīng)370C培養(yǎng)48h，觀察結(jié)果。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，試驗(yàn)重復(fù)5次。

1.4 聯(lián)合藥敏試驗(yàn)

采用棋盤(pán)微量稀釋法檢測(cè)，在96孔板上，將肉桂醛、鹽酸小檗堿、氟康唑藥物原液分別用RPMI1640培養(yǎng)基倍比稀釋?zhuān)谷夤鹑?、鹽酸小檗堿、氟康唑的終濃度為單用時(shí)測(cè)得該種菌株MIC值的1/8、1/4、1/2、1、2、4倍濃度。按照棋盤(pán)格法的設(shè)計(jì)方式，以縱、橫兩個(gè)方向。將不同濃度的兩種聯(lián)合藥物各50μL加入96孔板中，每孔再加入100μL配制好的菌懸液，分別混合后進(jìn)行藥物聯(lián)合作用。同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照孔及陰性對(duì)照孔，混勻。真菌培養(yǎng)步驟和藥理處理時(shí)間同上。

1.5 3種藥物的單獨(dú)及聯(lián)合對(duì)白念球菌PLB1mRNA表達(dá)水平的影響

試驗(yàn)設(shè)對(duì)照組、試驗(yàn)組，經(jīng)370C培養(yǎng)6～8h后，按照RNApure Yeast Kit酵母RNA提取試劑盒操作方法，提取各組總RNA，測(cè)定總RNA濃度和純度，在紫外透射儀上觀察，并掃描凝膠，檢測(cè)總RNA的完整性，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及PCR反應(yīng)。采用凝膠分析軟件對(duì)電泳結(jié)果分析，得到內(nèi)參TFF3、目的基因PLB1的灰度值，目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量用目的基因與內(nèi)參基因條帶的灰度值的比值來(lái)表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 藥物單獨(dú)及其聯(lián)合抗白念球菌藥敏實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

藥物單獨(dú)作用于白念球菌時(shí)：肉桂醛、鹽酸小檗堿、氯康唑抗白念球菌的MIC范圍分別為160～320、80～160和8～16μg/mL，其MIC80分別為：320、80、16μg/mL；藥物兩兩聯(lián)合作用于白念球菌時(shí)，單藥MIC值得幾何均數(shù)均顯著減少（見(jiàn)表1）。

表1 藥物聯(lián)合抗白念球菌作用效果評(píng)價(jià)

2.2 藥物對(duì)白念球菌相關(guān)PLB1基因mRNA表達(dá)的影響

通過(guò)RT-PCR技術(shù)，得到內(nèi)參基因TEF3和PLB1擴(kuò)增產(chǎn)物分別呈517bp和416bp條帶。其PLB1基因在mRNA的相對(duì)表達(dá)量水平。

3 討論

本研究通過(guò)肉桂醛、鹽酸小檗堿單獨(dú)及聯(lián)合氟康唑作用白念球菌，對(duì)白念球菌PLB1的表達(dá)水平進(jìn)行分析，檢測(cè)結(jié)果顯示：肉桂醛、鹽酸小檗堿單獨(dú)抗菌時(shí)，均可降低白念球菌酶基因PLB1mRNA的表達(dá)量，引起細(xì)胞外PL的分泌量降低，當(dāng)分別與氟康唑聯(lián)合時(shí)，其白念球菌酶基因PLB1mRNA的表達(dá)量要明顯低于藥物單用。由于肉桂醛和鹽酸小檗堿是中藥中的天然活性成分，植物資源豐富，且在長(zhǎng)期臨床應(yīng)用中少見(jiàn)不良反應(yīng)和毒副作用。因此，肉桂醛、鹽酸小檗堿聯(lián)合氟康唑聯(lián)合應(yīng)用的協(xié)同作用為今后抗真菌治療提供了新的思路。

參考文獻(xiàn)：

[1]譚心，王和，苑天紅，馬妍.肉桂醛與鹽酸小檗堿聯(lián)合氟康唑抗白念球菌作用的體外實(shí)驗(yàn)觀察[J].遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，36（3）：221-224.

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