霧靈鼻通噴霧劑微生物限度檢查方法建立與驗證

摘 要：目的: 建立并驗證霧靈鼻通噴霧劑的微生物限度檢查方法 方法: 采用薄膜過濾法檢查霧靈鼻通噴霧劑的微生物限度，并依據《中國藥典》2010年版收載的方法進行驗證。結果 :5種菌株的回收率均高于70% ，且控制菌檢查具有專屬性。結論 :采用薄膜過濾法檢查霧靈鼻通噴霧劑微生物限度可行。 關鍵詞：霧靈鼻通噴霧劑 微生物限度檢查 薄膜過濾法 霧靈鼻通噴霧劑為我院非標準制劑，具有抗菌消炎、收縮血管的作用，用于治療過敏性鼻炎、鼻竇炎、鼻黏膜腫脹，療效顯著。為加強制劑質量控制，根據《中國藥典》（2010年版）微生物限度檢查法要求，結合霧靈鼻通噴霧劑含有抑菌成分的特點，本實驗建立并驗證了供試品經薄膜過濾法處理后的微生物限度檢查方法，為規(guī)范本品的微生物限度檢查提供科學理論依據。 1儀器與材料 1.1儀器 雙層立式電熱蒸汽壓力消毒器（上海三申醫(yī)療器械有限公司）；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器械廠）；HTY-100型微生物限度檢驗儀（杭州泰林生物技術設備有限公司）；S60型微生物限度培養(yǎng)器（杭州泰林生物技術設備有限公司，孔徑0.45μm，濾膜直徑50mm）；垂直層流潔凈工作臺(CA-920-2，上海上凈凈化設備有限公司)；垂直層流潔凈工作臺（HFsafe-1200，上海力申科學儀器有限公司）；OLYMPUS-BX51型雙目顯微鏡；電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）等。 1.2培養(yǎng)基及稀釋液 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（批號：1005216）；玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號：1004222），改良馬丁液體培養(yǎng)基（批號：090330）；甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號：100111）；十六烷三甲基溴化銨瓊脂培養(yǎng)基（批號：1002221）；氯化鈉蛋白胨緩沖液（批號：1002021）；以上試劑均購自北京陸橋技術有限責任公司；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（北京奧博星生物技術有限責任公司，批號：20110602）；二鹽酸二甲基對苯二胺（天津市光復精細化工研究所）；0.9%氯化鈉注射液(NS)（四川科倫藥業(yè)股份有限公司，批號：110509，100mL/瓶）等。 1.3菌種 大腸埃希菌[CMCC(B)44102] 、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501] 、金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、白色念珠菌[CMCC(F)98001] 、銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]、黑曲霉菌[CMCC(F)98003]，以上菌株均由中國食品藥品檢定研究院提供，傳代次數不超過5代。 1.4樣品 霧靈鼻通噴霧劑（第三軍醫(yī)大學野戰(zhàn)外科研究所大坪醫(yī)院藥劑科，批號為：110329A，110601A，110811A） 2實驗方法[1-4] 2.1供試液制備 取樣品10mL，加pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液至100mL，制成1:10供試液，再取1:10供試液10mL，加pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液至100mL制成1:100供試液，作為試驗用供試液，備用。 2.2菌液制備 取經35℃培養(yǎng)18～24h的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的肉湯培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制備成每1mL含菌落數為50～100 cfu﹒mL-1的菌懸液；取經25℃培養(yǎng)24～48h的白色念珠菌液體培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制備成每1mL含菌落數為50～100 cfu﹒mL-1的菌懸液；取經25℃培養(yǎng)5～7d的黑曲霉斜面培養(yǎng)物，加3～5mL0.9%無菌氯化鈉溶液洗下霉菌孢子，吸取菌液用0.9%無菌氯化鈉溶液制備成每1mL含菌落數為50～100cfu/ml的孢子懸液，備用。 2.3細菌、霉菌及酵母菌回收率試驗 采用薄膜過濾計數法，按規(guī)定進行3次獨立的平行試驗，分別計算各試驗菌的回收率。 2.3.1試驗組 取1∶100供試液1mL，加入過濾器中，經薄膜過濾后，沖洗3次，每次100mL，在最后一次的沖洗液中各加入1mL的50～100 cfu﹒mL-1大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌菌液或黑曲霉孢子懸液，過濾。取出濾膜，菌面朝上貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上，分別置30～35℃培養(yǎng)48h或23～28℃培養(yǎng)72h。每株試驗菌平行制備2個平皿。按《中國藥典》（2010年版）菌落計數方法計數。 2.3.2菌液組 測定所加的試驗菌數。除不加供試液外，其余操作同試驗組。 2.3.3 供試品對照組 測定供試品本底菌數，除不加菌液外，其余操作同試驗組。 2.3.4稀釋液對照組 測定稀釋液是否干擾微生物生長。取稀釋液1mL代替供試液，其余操作同試驗組。 2.4回收率計算方法 稀釋液對照組的加菌回收率(%)=(稀釋液對照組平均菌落數/菌液組平均菌落數)×100%; 試驗組的加菌回收率(%)=［(試驗組平均菌落數-供試品對照組平均菌落數)/菌液組平均菌落數］×100%。 2.5控制菌檢查方法的驗證 2.5.1金黃色葡萄球菌檢查方法的驗證 驗證試驗進行3次獨立的平行試驗，每組平行制備2個平板，分別置30～35℃培養(yǎng)24～72h，觀察平板上菌落形態(tài)特征等，并取各組典型菌落涂片，革蘭染色后鏡檢。 2.5.1.1試驗組 取1:100供試液10mL，加入100mL無菌稀釋液中，混勻，過濾，用pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液沖洗3次，每次100mL，在最后一次的沖洗液中各加入10～100 cfu﹒mL-1金黃色葡萄球菌菌液1mL，過濾，取出濾膜，菌面朝上貼于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基的平板上。 2.5.1.2陰性菌對照組 加入10～100 cfu﹒mL-1大腸埃希菌菌液1mL代替金黃色葡萄球菌，其余操作同試驗組。 2.5.2銅綠假單胞菌檢查方法驗證 驗證試驗進行3次獨立的平行試驗，每組平行制備2個平板，分別置30～35℃培養(yǎng)24～72h，觀察平板上菌落形態(tài)特征等，并取各組典型菌落進行氧化酶試驗。 2.5.2.1試驗組 取1:100供試液10mL，加入100mL無菌稀釋液中，混勻，過濾，沖洗3次，每次100ml，在最后一次的沖洗液中各加入10～100cfu﹒mL-1銅綠假單胞菌菌液1mL，過濾，取出濾膜，菌面朝上貼于十六烷三甲基溴化銨瓊脂培養(yǎng)基的平板上。 2.5.2.2陰性菌對照組 加入10～100 cfu﹒mL-1大腸埃希菌菌液1mL代替銅綠假單胞菌，其余操作同試驗組。 3結果 3.1細菌、霉菌及酵母菌回收率 細菌培養(yǎng)48h，逐日點計菌落數，以48h的菌落數報告；霉菌培養(yǎng)72h，逐日點計菌落數，以72h的菌落數報告（見表1）。表1 薄膜過濾法細菌回收率(%)Tab1 The recovery of bacteria of membrane filtration(%) 3.2控制菌檢查方法驗證 3.2.1金黃色葡萄球菌 試驗組：菌落表面呈金黃色的圓形凸起，邊緣整齊，外圍有黃色環(huán)；鏡下為紫色深染的球狀菌體，呈葡萄串狀排列。判斷為檢出金黃色葡萄球菌。 陰性菌對照組：菌落特征及鏡檢結果為陰性。判斷為未檢出金黃色葡萄球菌。 3.2.2銅綠假單胞菌 試驗組：菌落較扁平，周邊擴散，表面濕潤，呈灰白色，周圍時有藍綠色素擴散。氧化酶試驗為陽性。判斷為檢出銅綠假單胞菌。 陰性對照組：菌落特征及鏡檢結果為陰性。判斷為未檢出銅綠假單胞菌。 （見表2）表2 控制菌檢查方法驗證結果Tab2 Results of validation of test method for control bacteria 4結論 實驗結果表明，采用薄膜過濾法能有效去除霧靈鼻通噴霧劑中的抑菌成分，避免其對試驗菌生長的影響，且測定的加菌回收率均在70%以上，并可檢出金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌，具有專屬性，符合《中國藥典》（2010年版）的相關規(guī)定。因此薄膜過濾法用于霧靈鼻通噴霧劑的微生物限度檢查具有準確性和專屬性。 5討論 供試液稀釋倍數的確定 取樣品10mL，加pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液至100mL，制成1:10供試液，但此稀釋級的供試液作為試驗用供試液時，經薄膜過濾后仍不能消除其抑菌作用，部分試驗菌的加菌回收率低于70%。然而取1:10供試液1mL，加pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液至10mL制成1:100供試液，作為試驗用供試液，經薄膜過濾后，各試驗菌的加菌回收率均高于70%。因此，實驗過程中選擇1:100供試液作為試驗用供試液。 沖洗液使用量及沖洗次數的確定 薄膜過濾的目的在于使微生物被濾膜充分截留，再用適量無干擾的沖洗液洗去供試品的干擾，就能準確地進行樣品的微生物限度檢查。然而沖洗液的用量是關鍵。若過量沖洗，會使菌體受損，不利于生長，從而影響回收率，還會使濾膜受損，孔徑改變，影響實驗結果。反之，如沖洗不充分，樣品抗菌作用就不能徹底消除，也無法保證實驗效果的準確性。經過驗證，本實驗過程中的沖洗液總量為300mL，且分為3次沖洗濾膜，既達到了消除供試品抑菌作用的目的，又盡量不干擾細菌的生長。 參考文獻 [1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[S].北京;化學工業(yè)出版社，2010.附錄76-88. [2]劉春棟，李惠梅.清露酊微生物限度檢查方法的建立與方法驗證[J].天津藥學，2010.22（6）:7-8. [3]林郁，尹文星.含抗菌、抑菌活性成分的7種醫(yī)院制劑的微生物限度檢查法驗證試驗[J]. 實用臨床醫(yī)藥雜志， 2009.13(11):55-56. [4]孟麗麗，陸娟，李曉波，邱興慶.燒傷搽劑微生物限度檢查法的驗證[J].中國藥師，2011.14(5):746-747.