波長變化HPLC法測定蛋糕中的合成著色劑

中圖分類號：TS207.3文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

摘要：目的 建立反相高效液相色譜法測定蛋糕中的5種合成著色劑的檢測方法。方法 樣品碾碎后用水溶解，經(jīng)沉淀蛋白和去脂肪處理后過濾，采用ZORBAX Eclipse XDB-C18反相柱，以甲醇和乙酸銨為流動(dòng)相，采用梯度洗脫、改變波長的方法進(jìn)行分析測定。結(jié)果 樣品中的5種混合著色劑得到很好的分離。在樣品中加入了5種著色劑標(biāo)準(zhǔn)，檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、亮藍(lán)，回收率在94.93-98.79% 。結(jié)論 當(dāng)使用低波長檢測時(shí)，流動(dòng)相使用很小的混合比例的誤差都會被放大，很有可能會使基線發(fā)生波動(dòng)。本試驗(yàn)采用最佳吸收波長HPLC法對5種合成著色劑進(jìn)行分離檢測，靈敏度較高，分離度良好，回收率滿意，適于蛋糕中合成著色劑的測定。

關(guān)鍵詞：反相高效液相色譜；蛋糕；著色劑

著色劑優(yōu)點(diǎn)不少，如色澤鮮艷，著色力強(qiáng)，色調(diào)多樣，它們分別用于果味水、果味粉、果子露、汽水、配制酒、紅綠絲、罐頭，以及糕點(diǎn)表面上彩等。然而，著色劑常以苯、甲苯、萘等化工原料經(jīng)過磺化、硝化、鹵化、偶氮化等一系列有機(jī)反應(yīng)而制得，因中間體和有害物質(zhì)的存在，合成著色劑具有一定的毒性。如偶氮類染料已被確定為不安全的，具有潛在的過敏反應(yīng)、致癌性[1，2]，各國對合成食用著色劑都嚴(yán)格控制使用范圍和使用量，我國GB2760—2011食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)中也規(guī)定了合成著色劑的使用范圍和使用量[3]。目前，國家標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法采用反相高效液相色譜法梯度洗脫來分離人工著色劑[4]，但是容易引起基線漂移，引起數(shù)據(jù)誤差。利用梯度洗脫方法檢測食品中的著色劑已有報(bào)道[5，6，7]。本文建立了以甲醇+乙酸銨（0.02 mol/L ，pH = 4.0）為流動(dòng)相， 采用梯度洗脫、改變波長的方法分析測定了蛋糕中的5種著色劑的方法。

1.材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260分析型高效液相色譜儀（Angilent，USA） ，包括Agilent ChemStation色譜工作站、四元梯度泵、真空脫氣箱、恒溫柱溫箱、二極管陣列檢測器（DAD ） 。色譜柱： 150 ×4.6 mm ， 5um ， ZORBAX Eclipse XDB-C18反相柱。

著色劑標(biāo)準(zhǔn)品：檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)溶液，均購于國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心，標(biāo)準(zhǔn)值0.500（mg/ml），GBW（E）100001；甲醇：色譜純（美國Honeywell Burdick ﹠Jackson公司）；乙酸銨為分析純試劑；聚酰胺粉過200目篩。樣品處理及溶劑配制全部使用哇哈哈純凈水。

1.2樣品的前處理

將蛋糕碾碎，準(zhǔn)確稱取5g試樣（精確到0.001g）， 放入100ml燒杯中， 加入30ml水，溫?zé)崛芙?、攪勻，加沉淀劑乙酸鋅（220g/L）、亞鐵氰化鉀（106g/L）各2ml，室溫靜止30分鐘，用檸檬酸溶液調(diào)PH值到6，加熱至60℃，將1g聚酰胺粉加少許水調(diào)成粥狀，倒入試樣溶液中，以G3垂融漏斗抽濾，用乙醇-氨水-水解吸，收集解吸液，乙酸中和，蒸發(fā)近干，加水溶解，定容5ml， 經(jīng)0.22um的微孔濾膜過濾，進(jìn)樣。

1.3 色譜條件的選擇

1.3.1 調(diào)整流速，確定流動(dòng)相的最佳洗脫梯度。

1.3.2 確定5種合成著色劑的最佳測定波長

2.結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相最佳梯度選擇

以國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法——等波長梯度洗脫法為依據(jù)[4]，經(jīng)多次調(diào)整，確定了流動(dòng)相最佳梯度，見表1。

2.2 波長最佳梯度選擇

在國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法中[4]，對各種合成著色劑的檢測是在254nm的波長下進(jìn)行測定的，由于在此波長下，所有的化學(xué)成分均有吸收，但此波長并不是各成分的最有效波長，檢測時(shí)檢測器里面的吸收一直產(chǎn)生變化，會出現(xiàn)許多干擾峰，導(dǎo)致基線波動(dòng)的發(fā)生，引起基線漂移或者有些成分不出峰，見圖2。正確選擇緩沖液對于優(yōu)化尖峰、檢出限和穩(wěn)定的保留時(shí)間十分重要，郭平[7]、林建忠[8]等曾采用調(diào)整波長的方法成功的分離了10種合成著色劑。本試驗(yàn)根據(jù)不同波長對著色劑的吸收強(qiáng)度不同的差異，經(jīng)多次調(diào)整，確定了檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃和亮藍(lán)5種合成著色劑的最佳波長梯度，見表2。

在最佳流動(dòng)相梯度與最佳波長梯度條件下5種合成著色劑的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見圖1，與國標(biāo)法圖2比較，可以看出5種著色劑得到了很好的分離，不但避免了基線的漂移，靈敏度也明顯的提高，雜質(zhì)峰也變小。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及方法檢出限

在設(shè)定的色譜條件下，各化合物濃度在1.0～50ug/ml時(shí)，濃度和峰面積有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.997，檢出限以噪音的3倍計(jì)算。各化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程、相關(guān)系數(shù)及方法檢出限見表3。

2.4樣品的檢測及加標(biāo)回收率

在相同的色譜條件下對20份蛋糕樣本進(jìn)行檢測，并在同一份樣本中進(jìn)行加標(biāo)，分別加入濃度為10、20ug/ml的5種著色劑混標(biāo)，計(jì)算加標(biāo)回收率。在20份蛋糕樣本中5種合成著色劑偶有檢出。加標(biāo)回收率的結(jié)果見表4，回收率滿意。

3.結(jié)論

本試驗(yàn)對采用色譜法測定合成著色劑的條件進(jìn)行優(yōu)化，避免了在低波長下梯度洗脫時(shí)基線的飄移，采用改變波長的方法測定不同著色劑檢出的靈敏度、精密度和準(zhǔn)確度均獲得滿意的結(jié)果，且滿足分析要求，為蛋糕中合成著色劑的檢測提供了很好的依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]鄭鵬然，周樹南，主編.食品衛(wèi)生全書[M].北京：紅旗出版社，1996，424.

[2]高鶴娟，主編.食品理化檢驗(yàn)方法“理化部分”注解[M].衛(wèi)生部食品衛(wèi)生監(jiān)督檢驗(yàn)所，1987，257-259.

[3]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB2760—2011食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)-食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2012.

[4]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB/T5009.35-2003食品中合成著色劑的測定[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2004.

[5]阮麗萍，吉文亮，劉華良，等.高效液相色譜法同時(shí)測定食品中10種合成著色劑[J].中國食品衛(wèi)生雜志，2011，23（2）.

[6]李必斌.食用合成色素檢測方法的研究進(jìn)展[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2002，12（6）

[7]郭平，金會會，李瑾瑾等.高效液相色譜法同時(shí)測定飲料中十種合成著色劑[C].食品安全技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)國際研討會暨AOAC中國區(qū)會議論文集，2011.

[8]林建忠.HPLC法測定食品中色素條件優(yōu)化的研究[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，1998， 8（4）：205-206.