ELISA測定中常見問題及原因分析

摘要：目前，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）是最為常用的感染性標(biāo)志物檢測手段，其測定結(jié)果的準(zhǔn)確、可靠性直接影響到臨床診斷及治療效果，在臨床實(shí)際操作過程中，常常會由于儀器、試劑、工作人員操作等方面的原因而影響ELISA測定結(jié)果。為進(jìn)一步提高ELISA測定結(jié)果的準(zhǔn)確性，本文主要分析了臨床實(shí)踐中常見的幾種問題及其原因，為臨床實(shí)踐提供重要的參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：ELISA測定；常見問題；原因分析

【中圖分類號】

R45 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】B 【文章編號】1002-3763（2014）07-0254-01

ELISA測定的主要原理是利用抗原、抗體之間的特異反應(yīng)通過某一種或幾種酶來連接待測物，通過底物和酶的相互作用，會改變?nèi)芤旱念伾?，進(jìn)而通過觀察溶液顏色來判定測定的結(jié)果^[1]。在醫(yī)院檢驗(yàn)科，ELISA是最為常用，也是最為重要的一種感染性標(biāo)志物檢測方法，筆者主要結(jié)合自己多年的經(jīng)驗(yàn)，針對ELISA測定實(shí)踐中存在的常見問題及其發(fā)生原因進(jìn)行剖析，具體分析如下。

1 常見問題

在醫(yī)院檢驗(yàn)科進(jìn)行ELISA測定過程中，常常會碰到整板顯色、白板、無法檢測出弱陽性質(zhì)控樣本以及測定重復(fù)性較差等問題。①整板顯色主要表現(xiàn)在沒有徹底清潔洗板，污染了洗液，進(jìn)而導(dǎo)致顯色液毀壞、變質(zhì)，或者是加反酶結(jié)合物，通常這種問題主要存在于HBsAb、HBsAg測定中。②白板主要是指整板無色，也將陽性對照包括在內(nèi)，比如像洗液中存在酶抑制劑，酶結(jié)合物漏加，顯色劑漏加A或B?；蛘呤菍⒔K止劑當(dāng)做顯色劑用。③無法檢測出弱陽性質(zhì)控樣本。比如顯色時(shí)間不足，不能準(zhǔn)確判定樣本測定結(jié)果；或者是溫度沒有達(dá)標(biāo)，溫育時(shí)間不足等。④測定重復(fù)性較差。具體指標(biāo)本處理方法不對，沒有正確處理酶標(biāo)儀濾光片，混合應(yīng)用不同批號的試劑組，微板孔條受到污染，顯色時(shí)間、洗板時(shí)間、溫育時(shí)間協(xié)調(diào)不一，樣本加錯(cuò)，樣本添加不準(zhǔn)確。

2 常見的問題原因分析

2.1 假陰性出現(xiàn)的原因分析及建議：

導(dǎo)致假陰性的原因主要包括以下幾種情況，①如果檢測大批量樣本，實(shí)驗(yàn)室檢測人員的工作量比較大，有時(shí)候可能觀察樣本呈色不及時(shí)，很多樣本在實(shí)驗(yàn)者觀察時(shí)，結(jié)果已經(jīng)褪色，導(dǎo)致樣本呈現(xiàn)假陰性。②試劑自身的質(zhì)量并沒有達(dá)標(biāo)，比如已經(jīng)過了保質(zhì)期，試劑保存的方法不恰當(dāng)，在試劑運(yùn)輸?shù)倪^程中，破壞了樣本，蒸餾質(zhì)存在其他混合物。如果缺乏陰陽對比，極易出現(xiàn)假陰性。③溫育、溫度不充分，作用時(shí)間過短，忘記添加底物顯色劑或者酶標(biāo)二抗等，這些原因都可能導(dǎo)致出現(xiàn)假陰性。④部分生產(chǎn)試劑廠家經(jīng)濟(jì)條件較差，儀器、設(shè)備等比較落后，特別是若為人工包被的話，和普通試劑相比，生物活性材料存在很大不同，常常容易出現(xiàn)“漏包”、抗體（抗原）失去活性或活性不足等現(xiàn)象，進(jìn)而出現(xiàn)假陰性。⑤在檢測的過程中，加樣技術(shù)非常重要，由于ELISA 測定法僅僅是微量樣品，如果多加1ul樣品或者少加1ul樣品，極易導(dǎo)致檢測標(biāo)本的測定結(jié)果一時(shí)陽性，一時(shí)陰性。

目前，很多廠家為了增加視覺的直觀性，更加容易區(qū)分樣本的陰陽性，常常會利用濃度較高、陽性較強(qiáng)的對照作為陰陽對照的參考，這樣的后果是在肉眼觀察樣本測定結(jié)果的過程中，極易出現(xiàn)模棱兩可的局面而無法直接判斷出結(jié)果，必須在酶標(biāo)儀的輔助下才可以準(zhǔn)確判讀結(jié)果。但是由于酶標(biāo)儀的靈敏度較低，重復(fù)性良好，可能有5%左右試劑盒陽性率會漏掉。因此筆者認(rèn)為，臨床在HBsAg 檢測過程中，同時(shí)也應(yīng)該檢測1 IU/ml 的臨界值血清。在樣品中不要添加Na2N3，避免酶活力受到抑制。且建議在醫(yī)院檢驗(yàn)科應(yīng)配備洗板機(jī)，避免出現(xiàn)洗板次數(shù)過多、沖力過大、浸泡過長等影響樣本檢測正確性的現(xiàn)象。

2.2 樣本假陽性的原因分析及其建議：

導(dǎo)致樣本出現(xiàn)假陽性的原因主要包括以下幾種情況：

2.2.1 吸附作用。很多SLE或者類風(fēng)濕等具有自身免疫疾病患者，他們的血清中常常會存一些特殊組成成分對樣本測定的結(jié)果準(zhǔn)確性造成影響，比如在包被板上會輕微吸附著一些IgG 抗體，這些附著的IgG抗體會導(dǎo)致之前顯示陰性樣本顯色，這種情況顯然是失真的。如果遇到這種情況建議結(jié)合樣本具體情況進(jìn)行判斷，并且應(yīng)該在樣本測定結(jié)果中標(biāo)注特殊情況。

2.2.2 標(biāo)本中雜質(zhì)的影響。在檢測標(biāo)本中，如果血液樣本黏稠度過高，血清脂質(zhì)含量、膽紅素含量、血紅蛋白含量等過高，都會干擾ELISA測定結(jié)果，出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

2.2.3 內(nèi)源性物質(zhì)。據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)^[3]，大約有40%左右的學(xué)者認(rèn)為樣本血清中都存在某些對ELISA測定結(jié)果存在交叉反應(yīng)物質(zhì)、醫(yī)源性誘導(dǎo)抗鼠Ig（s）抗體、嗜異性抗體、補(bǔ)體、類風(fēng)濕因子或者其他干擾作用物質(zhì)等，在一定程度上會干擾樣本測定結(jié)果的準(zhǔn)確性，會導(dǎo)致樣本檢測結(jié)果出現(xiàn)假陽性。

2.2.4 外源性物質(zhì)。在采集樣本和保存樣本的過程中，常常會由于實(shí)驗(yàn)室操作人員操作不規(guī)范而導(dǎo)致樣本測定結(jié)果出現(xiàn)假陽性。比如：①樣本溶血現(xiàn)象。這種問題常常是由于人為操作因素所致，在破壞溶解紅細(xì)胞過程中會產(chǎn)生大量血紅蛋白，ELISA的標(biāo)記主要以辣根過氧化物酶為主，而這些血紅蛋白的過氧化物酶活性較強(qiáng)，因此一旦采集標(biāo)本出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，會出現(xiàn)非特異性顯色反應(yīng)，導(dǎo)致樣本檢測出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象。因此臨床檢驗(yàn)實(shí)踐中應(yīng)重視標(biāo)本溶血問題。②保存標(biāo)本的方法不恰當(dāng)，如果存放存標(biāo)本的時(shí)間在1d以上，則很容易導(dǎo)致標(biāo)本活性喪失或大大降低，出現(xiàn)假陰性問題。如果標(biāo)本待檢時(shí)間過長，標(biāo)本血清中IgG 抗體極易形成多聚體，而AFP抗體極易形成二聚體，二聚體和多聚體相互結(jié)合極易導(dǎo)致本底過深，進(jìn)而使樣本測定結(jié)果出現(xiàn)假陽性。因此在臨床檢測過程中，應(yīng)該在最短的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行ELISA 測定，如果由于特殊情況必須將測定時(shí)間延長，則應(yīng)該將標(biāo)本存放環(huán)境設(shè)定為4℃恒溫（5d內(nèi)）。若標(biāo)本在7d后檢測，應(yīng)采取低溫冷凍處理，在檢測前再測解凍，并輕輕充分搖勻后測定。

2.2.5 并沒有全面凝集標(biāo)本。由于血液采集后在30min-2h后逐漸開始凝固，在24h左右會完全凝固，因此在ELISA 檢測過程中，常常會在血液標(biāo)本中適當(dāng)添加一些促凝劑或抗凝劑，為了爭取有效的檢測時(shí)間會強(qiáng)行將血清分離出來。此時(shí)血清中仍然有部分纖維蛋白原殘留，并極易形成纖維蛋白塊，這些肉眼可見的纖維蛋白塊會使實(shí)驗(yàn)者判斷失誤，導(dǎo)致樣本測定出現(xiàn)假陽性。這種問題其實(shí)比較好解決，導(dǎo)致這種現(xiàn)象的主要原因是血液還沒有完全凝固所致，臨床檢測時(shí)只需要待血液完全凝固后分離血清即可。如果特殊情況下需要快速檢測，則應(yīng)該使用分離膠采血管或者加入一定量促凝劑。

2.3 檢測操作誤差： ELISA 測定基本上都是手工操作，會無可避免的存在某些誤差，如果樣品加入時(shí)間，加入試劑以及混合時(shí)間存在出入，極易造成操作時(shí)差。在操作過程中，應(yīng)在加樣后輕輕混合均勻，不能混用不同批號試劑，試劑瓶和試劑蓋應(yīng)仔細(xì)檢查，避免出現(xiàn)張冠李戴現(xiàn)象。應(yīng)確保試劑保存的溫度、保存時(shí)間、洗滌方法、顯色條件等保持一致，在檢測時(shí)應(yīng)注意避免試劑、樣本、板以及吸頭污染。若在閾值附近出現(xiàn)檢測結(jié)果時(shí)陰時(shí)陽現(xiàn)象，不要急于做出判斷，應(yīng)重復(fù)多次進(jìn)行檢測，最終的檢測結(jié)果應(yīng)以偶數(shù)結(jié)果為判定標(biāo)準(zhǔn)。

根據(jù)以上常見問題及其原因的分析，主要存在樣本測定結(jié)果假陰性、假陽性等問題，應(yīng)綜合考慮人為操作因素、試劑因素、標(biāo)本因素等多方面影響，及早查明影響ELISA 測定的根本原因，并及時(shí)糾正進(jìn)行重新測定，確保ELISA 測定結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性，為臨床提供科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] 譚愛華.ELISA 法檢測中應(yīng)注意的問題[J].實(shí)用醫(yī)技雜志，2012，15（19）：2496.

[2] 周先碗，胡曉倩.生物化學(xué)儀器分析與實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2012：274.