黃芩水煎液及聯(lián)合硫酸慶大霉素對銅綠假單胞菌生物膜的體外影響

摘要：目的： 研究黃芩水煎液體外對銅綠假單胞菌生物膜的影響及其與硫酸慶大霉素的協(xié)同殺菌效果。 方法： 采用對倍稀釋法和MTT法檢測黃芩水煎液對銅綠假單胞菌最低抑菌濃度（MIC）及其生物膜MIC（SMIC）的作用，及其與硫酸慶大霉素協(xié)同的效果。 結(jié)果： 黃芩水煎液對銅綠假單胞菌的MIC為1.95mg/ml， SMIC為31.25mg/ml，黃芩水煎液濃度在3.93mg/ml或以上時(shí)硫酸慶大霉素有明顯的抗菌協(xié)同作用。 結(jié)論： 黃芩水煎液體外對銅綠假單胞菌生物膜的形成有較為明顯的抑制作用，與硫酸慶大霉素聯(lián)合用藥有一定的抗菌協(xié)同作用。

關(guān)鍵詞：黃芩水煎液；銅綠假單胞菌；生物膜

【中圖分類號】

R917 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】B 【文章編號】1002-3763（2014）07-0072-01

1 前言

銅綠假單胞菌是引起粘膜和創(chuàng)傷感染最常見的革蘭氏陰性菌，其極易形成生物膜，產(chǎn)生耐藥性。在國內(nèi)研究表明，清熱解毒藥物中的某些藥物對治療慢性感染有較好的效果。為了更多的發(fā)掘出抗銅綠假單胞菌生物膜的藥物，本課題從清熱解毒藥物中選取黃芩，研究其對銅綠假單胞菌生物膜的影響，以及與抗生素合用的協(xié)同作用，為黃芩抗銅綠假單胞菌生物膜和聯(lián)合硫酸慶大霉素用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

2 材料與儀器

2.1 材料：銅綠假單胞菌1株，由安徽中醫(yī)學(xué)院微生物與免疫教研室于臨床分離獲得，并經(jīng)鑒定。黃芩100 g，購于國泰大藥房。水煎2次，合并濃縮成50%濃度藥液（含生藥500mg/ml）。硫酸慶大霉素注射液，80mg/2ml（湖北同濟(jì)奔達(dá)鄂北制藥有限公司）。胰酶大豆肉湯（杭州微生物試劑有限公司）。四甲基偶氮唑鹽（MTT，Sigma公司），二甲基亞砜（DMSO，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，分析純）。

2.2 檢測儀器：318酶標(biāo)儀（上海三科儀器有限公司），96孔微量培養(yǎng)板（杭州生友生物技術(shù)有限公司），DPH-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）。倒置顯微鏡（OLYMPUS C×41）

3 方法

3.1 細(xì)菌計(jì)數(shù)：菌落計(jì)數(shù)法測定細(xì)菌濃度：2.98×1014CFU/ml；調(diào)整濃度至2.98×105 CFU/ml、2.98×109 CFU/ml，備用。

3.2 黃芩水煎液對銅綠假單胞菌MIC的測定：依據(jù)NCCLS 的M27- A 方案^[3]，將黃芩水煎液以胰酶大豆肉湯稀釋成10個(gè)濃度梯度：500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.87、3.93、1.95、0.98 mg/ml，分別加入96孔板，100μl/孔，每個(gè)濃度8個(gè)復(fù)孔。加入調(diào)整至2.98×109CFU/ml菌體的混懸液100μl，37℃培養(yǎng)48h，接種于無菌固體培養(yǎng)皿中，37℃培養(yǎng)24h，以無菌生長的最小藥物稀釋度作為銅綠假單胞菌的MIC。

3.3 黃芩水煎液對銅綠假單胞菌SMIC：將100μl調(diào)整至2.98×105CFU/ml的細(xì)菌懸浮液分別加入96孔板，37℃培養(yǎng)48h，使銅綠假單胞菌完全粘附于平底的96孔板表面，形成銅綠假單胞菌生物膜的結(jié)構(gòu)。生物膜形成后，棄去培養(yǎng)基及懸浮菌，用PBS洗3次，將黃芩水煎液以胰酶大豆肉湯稀釋成10個(gè)濃度梯度：500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.87、3.93、1.95、0.98 mg/ml，分別加入96孔板，100μl/孔，每個(gè)濃度8個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48h，倒置顯微鏡下觀察其形成情況。MTT法檢測抑制生物膜的藥物濃度：即50μl的MTT溶液（ 貯存液含5mg/ml PBS， 臨用前用預(yù)溫的0.15M PBS 按1∶5 稀釋） 加入每孔中， 37℃孵育5h。棄去含MTT 的培養(yǎng)基， PBS 洗3 遍， 加入DMSO 100μl， 振蕩5min， 在酶標(biāo)儀492nm 波長下檢測吸光度。設(shè)未加藥孔為空白對照。

3.4 硫酸慶大霉素對銅綠假單胞菌MIC的測定：將硫酸慶大霉素注射液以胰酶大豆肉湯稀釋成10個(gè)濃度梯度：125、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95、0.98、0.49、0.25μg/ml，分別加入96孔板，100μl/孔， 每個(gè)濃度8個(gè)復(fù)孔。加入調(diào)整至2.98×105CFU/ml菌體的混懸液，100μl/孔。37℃培養(yǎng)48h， 接種于無菌固體培養(yǎng)皿中，37℃培養(yǎng)24h，以無菌生長的最小藥物稀釋度作為銅綠假單胞菌的MIC。

3.5 黃芩水煎液聯(lián)合硫酸慶大霉素對銅綠假單胞菌的MIC：將黃芩水煎液以胰酶大豆肉湯稀釋成10個(gè)濃度梯度：500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.87、3.93、1.95、0.98 mg/ml，分別加入96孔板，50μl/孔， 每個(gè)濃度8個(gè)復(fù)孔。加入濃度調(diào)整為0.98μg/ml的硫酸慶大霉素注射液，50μl/孔。加入調(diào)整至2.98×109CFU/ml菌體的混懸液100μl，37℃培養(yǎng)48h， 接種于無菌固體培養(yǎng)皿中，37℃培養(yǎng)24h，以無菌生長的最小藥物稀釋度作為銅綠假單胞菌的MIC。觀察其是否有抗菌協(xié)同作用。

4 結(jié)果

4.1 黃芩水煎液、硫酸慶大霉素、黃芩水煎液聯(lián)合硫酸慶大霉素對銅綠假單胞菌MIC：

由表1可知，黃芩水煎液與硫酸慶大霉素聯(lián)合用藥有一定的抗銅綠假單胞菌協(xié)同作用。

4.2 黃芩水煎液對銅綠假單胞菌SMIC： 經(jīng)MTT法檢測，黃芩水煎液對銅綠假單胞菌SMIC為31.25mg/ml。倒置顯微鏡下觀察結(jié)果見圖1。

圖1 倒置顯微鏡下觀察銅綠假單胞菌的生物膜情況（×4000）

a.對照孔，b.銅綠假單胞菌培養(yǎng)24h（未形成生物膜），c. 銅綠假單胞菌培養(yǎng)48h（形成生物膜），d.藥物濃度31.25 mg/ml作用后銅綠假單胞菌的生物膜，e. 藥物濃度125mg/ml作用后銅綠假單胞菌的生物膜

由上可知，黃芩水煎液藥物濃度在3.93mg/ml以下時(shí)對銅綠假單胞菌無顯著性抑制作用；藥物濃度達(dá)到3.93mg/ml或以上時(shí)抑制效果較為明顯。

5 討論

為了從中藥中發(fā)掘具有抗銅綠假單胞菌BF的藥物，本實(shí)驗(yàn)通過研究清熱解毒藥中的黃芩在體外對銅綠假單胞菌BF的影響，來尋找抗銅綠假單胞菌BF的更為有效的新藥。結(jié)果顯示，黃芩水煎液對銅綠假單胞菌懸浮菌的最低抑菌濃度（MIC）為1.95mg/ml，對生物膜的SMIC為31.25mg/ml，黃芩水煎液濃度在0.98mg/ml或以上時(shí)對硫酸慶大霉素有協(xié)同作用。

黃芩水煎液聯(lián)合硫酸慶大霉素對銅綠假單胞菌作用的結(jié)果表明，黃芩水煎液與硫酸慶大霉素聯(lián)合用藥有一定的協(xié)同作用，其產(chǎn)生協(xié)同作用的機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，生物膜是黃芩抗銅綠假單胞菌的作用靶點(diǎn)之一，其是否有其它靶點(diǎn)值得進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

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