補(bǔ)骨脂提取溶媒研究及提取物含量測(cè)定

摘要：以補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量為指標(biāo)，建立檢測(cè)方法來測(cè)定補(bǔ)骨脂提取物的含量。采用不同溶媒對(duì)補(bǔ)骨脂進(jìn)行提取，通過提取物中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的得率、經(jīng)濟(jì)成本、安全性等角度來衡量最佳提取溶媒。結(jié)果表明，在相同溶劑倍量、提取時(shí)間和提取次數(shù)的條件下用80%乙醇為提取補(bǔ)骨脂中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的最佳溶媒。

關(guān)鍵詞：補(bǔ)骨脂； 提取溶劑； 含量測(cè)定

【中圖分類號(hào)】

R917 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B 【文章編號(hào)】1002-3763（2014）07-0056-02

補(bǔ)骨脂別名和蘭莧、胡韭子等，為豆科植物補(bǔ)骨脂（Psoralea Corylifolia L.）的干燥成熟果實(shí)。主產(chǎn)于四川、河南、陜西、安徽等地。具有補(bǔ)腎壯陽(yáng)、溫脾止瀉之功效，外用治療白癜風(fēng)。現(xiàn)代藥理研究表明其具有舒張支氣管平滑肌、抗衰老、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、增強(qiáng)皮膚色素等作用，是治療白癜風(fēng)的特效藥。補(bǔ)骨脂素（Psoralen）和異補(bǔ)骨脂素（Iso psoralen）為呋喃香豆精類化合物，具有光敏、抗癌、解痙及止血等作用，是補(bǔ)骨脂的主要有效成分，補(bǔ)骨脂中還含有黃酮及查爾酮類化合物。中成藥中補(bǔ)骨脂和異補(bǔ)骨脂的測(cè)定方法已有較多報(bào)道，但對(duì)補(bǔ)骨脂提取溶媒的研究還未見有報(bào)道。本文以補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量為指標(biāo)，考察了補(bǔ)骨脂的提取溶媒，從而為進(jìn)一步開發(fā)補(bǔ)骨脂提供了一定的理論依據(jù)。同時(shí)為補(bǔ)骨脂提取物的生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與試劑

1.1 儀器：HP1100高效液相色譜儀系列（美國(guó)惠普），在線脫氣、四元泵、紫外檢測(cè)器，HP化學(xué)工作站；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋；梅特勒精密電子天平。

1.2 試劑：甲醇（色譜純）、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、無水乙醇（所用試劑均為分析純）；補(bǔ)骨脂素對(duì)照品，批號(hào)739-9203；異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品，批號(hào)738-8802（中國(guó)藥品生物制品檢定所提供）；補(bǔ)骨脂藥材購(gòu)自安徽亳州四海藥材公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 檢測(cè)方法的建立

2.1.1 色譜條件的建立： 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 將補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品分別用甲醇制成對(duì)照品溶液，進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果兩者均在245nm和295nm波長(zhǎng)處有最大吸收，但245nm 波長(zhǎng)處，兩者吸收均更靈敏，在此波長(zhǎng)下，可減小進(jìn)樣量，從而減少對(duì)色譜柱的污染，陰性對(duì)照無干擾，因此選定245nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

流動(dòng)相的選擇 分別用體積比為80：20，70：30，60：40，50：50，40：60，30：70的甲醇-水系統(tǒng)作為流動(dòng)相，對(duì)補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素同時(shí)進(jìn)行HPLC測(cè)定。結(jié)果表明：在以甲醇：水（50：50，V/V）為流動(dòng)相，補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的分離度好，無雜質(zhì)峰干擾，且相對(duì)保留時(shí)間適中。

色譜條件 色譜柱：Hypersil ODS 柱（250×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（50：50，V/V）；流速1.0ml·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)245nm；柱溫40℃；進(jìn)樣量20μl；測(cè)定時(shí)間約為12min。

色譜圖：見圖1，圖2。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：

分別精密稱取補(bǔ)骨脂素對(duì)照品5.8mg、異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品4.7mg置100ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。用甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，配成5.8，11.6，17.4，23.2，29.0μg/ml系列濃度的補(bǔ)骨脂素溶液；4.7，9.8，14.1，18.8，23.5μg/ml系列濃度異補(bǔ)骨脂素溶液。經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液20μl進(jìn)樣，在上述色譜條件下進(jìn)行HPLC分析，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），以濃度為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明：補(bǔ)骨脂素在5.8～29. 0μg/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y =16235.35x- 2466.84，r=0.9999；異補(bǔ)骨脂素在4.7～23.5μg/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=15535.44x-6638.67，r=0.9997。

2.1.3 樣品溶液的制備：

補(bǔ)骨脂藥材25g粉碎成60目粗粉，加入8倍量的甲醇回流提取3次，每次提取2小時(shí)，合并濾過液，蒸干，殘?jiān)眉状既芙?，定容?5ml，再取1ml，用甲醇稀釋至10ml，密封，低溫避光保存，備用。

2.1.4 精密度實(shí)驗(yàn)：

儀器精密度 分別吸取上述一定濃度的補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的對(duì)照品溶液，在上述色譜條件下，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表1：

2.1.5 樣品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)：

取樣品溶液低溫避光放置0，1，2，4，6，8，10，12，24h后，在上述色譜條件下測(cè)定。結(jié)果表明，樣品溶液中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素在低溫避光條件下24h內(nèi)穩(wěn)定性良好，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD分別為2.31%和1.72%。

2.1.6 對(duì)照品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)：

取對(duì)照品溶液低溫避光放置0，1，2，4，6，8，10，12，24h后，在上述色譜條件下測(cè)定。結(jié)果表明，對(duì)照品溶液中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素在低溫避光條件下24h內(nèi)穩(wěn)定性良好，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD分別為2.19%和1.98%。

2.1.7 回收率試驗(yàn)：

取樣品補(bǔ)骨脂25g，分別精密加入一定量的對(duì)照品溶液，8倍量的甲醇回流提取3次，每次提取2小時(shí)，在上述色譜條件下測(cè)定，平均回收率結(jié)果見表2。

2.2 提取溶媒及工藝

2.2.1 提取溶媒的選擇：

補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素為香豆素成分，在有機(jī)溶劑中的溶解度會(huì)大些，但溶劑極性太小又會(huì)影響其提取物的得率，從而影響其收率。所以本實(shí)驗(yàn)采用了石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、無水乙醇、65%的甲醇溶液、80%的甲醇溶液、95%的甲醇溶液、65%的乙醇溶液、80%的乙醇溶液、95%的乙醇溶液、水13種溶媒對(duì)補(bǔ)骨脂進(jìn)行回流提取。

2.2.2 提取工藝：

將補(bǔ)骨脂粉碎成60目左右的粗粉，稱取100g粗粉13份，分別置于1500ml的圓底燒瓶中，編號(hào)1～13號(hào)，再分別量取石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、無水乙醇、65%的甲醇水溶液、80%的甲醇溶液、95%的甲醇溶液、65%的乙醇溶液、80%的乙醇溶液、95%的乙醇溶液、水800ml，水浴加熱回流提取2小時(shí)，150目濾布過濾，濾渣再加入各自溶劑800ml，再回流提取、過濾。共提取三次，合并濾液，回收濾液至稠膏狀，于真空烘箱內(nèi)80℃減壓烘干，研磨成干粉，稱重，計(jì)算收率。取干粉1g，溶于500ml甲醇，超聲30分鐘，過濾，取溶液1ml用甲醇稀釋10倍，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，作為樣品溶液，利用上述方法學(xué)進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果如下表3：

甲醇和乙醇提取能力相近，不同濃度的甲醇和乙醇的提取能力基本相當(dāng)，其中80%的甲醇和80%的乙醇稍好些，雖然甲醇成本低于乙醇，但由于甲醇毒性較大，對(duì)環(huán)境不利，最好選擇80%的乙醇作為提取補(bǔ)骨脂的最佳溶劑。

2.2.3 將80%乙醇提取過的殘?jiān)儆?倍量提取2小時(shí)，得到含量為0.82%的浸膏9.5g，占前三次所提取出來的香豆素的7.5%，可以認(rèn)為沒有進(jìn)行第四次提取的必要。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇：補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素兩者均在245nm和295nm波長(zhǎng)處有最大吸收，但245nm 波長(zhǎng)處兩者吸收均更靈敏，在此波長(zhǎng)下，可減小進(jìn)樣量，從而減少對(duì)色譜柱的污染，陰性對(duì)照無干擾，因此選定245nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

3.2 雖然香豆素類成分具有遇堿開環(huán)，遇酸環(huán)合的性質(zhì)，但由于補(bǔ)骨脂中含有大量油脂和糖類成分，易發(fā)生皂化反應(yīng)和形成糊狀物，難以過濾，因此一般不采用堿液中加熱開環(huán)，酸液中閉環(huán)的原理來提取。

3.3 本實(shí)驗(yàn)中補(bǔ)骨脂提取工藝中統(tǒng)一用8倍量溶媒提取3次，每次2小時(shí)，基本上可以將補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素提取完全，提取率為90%左右。

3.4 雖然補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素在有機(jī)溶劑中有較好的溶解度，但有機(jī)溶劑如石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮等的穿透力相對(duì)較弱，香豆素類難以溶出，同時(shí)造成提取率偏低，水的穿透力較強(qiáng)，但對(duì)香豆素類的溶解度較小，提取率也偏低，純甲醇和純乙醇溶劑提取會(huì)造成成本增高，所以選用甲醇溶液和乙醇溶液，同時(shí)從綠色、安全的角度考慮，選用80%的乙醇溶液。

4 結(jié)論

4.1 通過對(duì)檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇、流動(dòng)相選擇，確定檢測(cè)方法的條件為：流動(dòng)相采用甲醇-水（50：50，V/V）；檢測(cè)波長(zhǎng)為245nm；流速為1.0ml·min-1；柱溫為40℃；測(cè)定時(shí)間約為12分鐘。

4.2 通過精密度、穩(wěn)定性、加樣回收實(shí)驗(yàn)可以確定本檢測(cè)方法適用于補(bǔ)骨脂提取物的含量測(cè)定。

4.3 通過13種溶媒對(duì)補(bǔ)骨脂提取得率，香豆素得率的分析，同時(shí)考慮經(jīng)濟(jì)、環(huán)保等因素，選定80%的乙醇為補(bǔ)骨脂中提取補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的最佳溶劑。

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