酪氨酸酶抑制劑的研究進(jìn)展

摘要：目的：酪氨酸酶（EC 1.14.18.1.PPO）是一種含銅的氧化酶，是生物體合成黑色素的關(guān)鍵酶。其活性與人的色素障礙性疾病及惡性黑色素腫瘤密切相關(guān)，也與果蔬褐化、昆蟲表皮鞣化有重要關(guān)系。酪氨酸酶抑制劑用途廣泛，其研究成為近年來國內(nèi)外研究熱點(diǎn)?，F(xiàn)對(duì)酪氨酸酶抑制劑對(duì)酪氨酸酶的抑制作用和構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行綜述。

關(guān)鍵詞：酪氨酸酶；抑制劑；抑制機(jī)理；構(gòu)效關(guān)系

【中圖分類號(hào)】 R914 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A【文章編號(hào)】1002-3763（2014）02-0016-02

酪氨酸酶（EC 1.14.18.1，Tyrosinase）是一種含銅的金屬酶，廣泛存在于人體、動(dòng)植物及微生物中。酪氨酸酶具有獨(dú)特的雙重催化功能，是生物體內(nèi)黑色素合成的關(guān)鍵酶，參與決定哺乳動(dòng)物皮膚、毛發(fā)的顏色，與人的衰老，昆蟲的傷口愈合與發(fā)育，果蔬的褐變有密切關(guān)系 。酪氨酸酶抑制劑除治療色素障礙性皮膚病外，已被用于果蔬保鮮、化妝品中的增白劑、生物農(nóng)藥的殺蟲劑添加物。本文就酪氨酸酶抑制劑的發(fā)展、抑制機(jī)理及構(gòu)效關(guān)系等方面做一綜述。

酪氨酸酶概況

在植物中，酪氨酸酶稱為多酚氧化酶；在昆蟲中，則稱為酚氧化酶；在微生物和人體中，才稱為酪氨酸酶。酪氨酸酶是一種以Cu2+為輔助因子的金屬酶，每一個(gè)亞基含2個(gè)金屬銅離子，2個(gè)銅離子分別與蛋白質(zhì)分子中2個(gè)平展的組氨酸和1個(gè)弱的直立組氨酸配體結(jié)合，另有1個(gè)內(nèi)源橋基將2個(gè)銅離子聯(lián)系在一起，構(gòu)成酪氨酸酶催化氧化反應(yīng)活性中心，酪氨酸等底物與酶形成過渡態(tài)絡(luò)合物時(shí)，主要是羥基與酶的活性中心上的原子鍵合而發(fā)生作用。在催化過程中，由于酪氨酸酶的復(fù)雜的存在形態(tài)，從而存在相對(duì)較多的構(gòu)象不同的底物與其結(jié)合[1]。這也許是酪氨酸酶抑制劑結(jié)構(gòu)多樣的原因。

酪氨酸酶兼有加氧酶和氧化酶的雙重功能，在黑色素合成過程中起關(guān)鍵作用。它能夠催化單酚羥化成二酚，并把二酚氧化成醌；醌在非酶促條件下形成最終的反應(yīng)產(chǎn)物黑色素。酪氨酸酶作為黑色素合成的關(guān)鍵酶，其異常過量表達(dá)可導(dǎo)致人體的色素沉著性疾病如黑色素瘤，色斑，這種疾病屬于多發(fā)病，因此酪氨酸酶抑制劑在醫(yī)學(xué)上具有重要的價(jià)值。

2.酪氨酸酶抑制劑

2. 1 已知結(jié)構(gòu)的酪氨酸酶抑制劑及其構(gòu)效關(guān)系

2.1.1 化學(xué)及微生物來源的抑制劑

氫醌是早期使用的脫色劑之一。氫醌作用于酪氨酸酶組成氨基酸，使其失活，屬于混合型抑制劑。氫醌在酪氨酸酶作用下被氧化成有毒性的半醌基物質(zhì)，使黑素細(xì)胞胞膜脂質(zhì)發(fā)生氧化，導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞，引起細(xì)胞死亡后來發(fā)現(xiàn)氫醌的細(xì)胞毒性很高，研究表明其有致癌的可能，現(xiàn)已逐漸停用。

1907年，受釀造醬油的操作工人白于常人的手啟發(fā)，從溜曲霉中分離出曲酸。曲酸的作用機(jī)制是通過與酪氨酸酶上作為輔酶的銅嵌合，從而達(dá)到抑制效果。但曲酸口服有致癌性，長期使用可增加卵巢細(xì)胞染色體畸變的概率。

還有含汞制劑，過氧化氫等，都是毒性較大的物質(zhì)，這促使人們轉(zhuǎn)向從植物或微生物中尋找天然安全高效的酪氨酸酶抑制劑，并應(yīng)用于臨床。

2.1.2 植物中分離的到的酪氨酸酶抑制劑

1988年，日本學(xué)者Akiu等從杜鵑花科植物熊果的葉中分離到一種具有脫色作用的單體物質(zhì)熊果苷，而其對(duì)酪氨酸酶出色的抑制活性和低毒性被人們所樂于接受。自此從植物分離天然酪氨酸酶抑制劑得到人們的普遍關(guān)注。

近年來從植物中分離得到的酪氨酸酶抑制劑種類繁多，包括糖苷類，黃酮類，苯丙素類，皂苷類，多糖等，幾乎涉及到所有已知的種類。

2.1.2.1 羧酸類

美國伯克利大學(xué)的Kubo教授一直致力于酪氨酸酶抑制劑的研究。1994年從漆樹科植物腰果Anaceardium occidentale L.的果實(shí)中提取了5-[8（z），11（z），14-pentadecatrieny1]resorcinol和6-[8（z），11（z），14-pentadecatrieny1] salicylic acid

都競爭性抑制蘑菇酪氨酸酶對(duì)L—DOPA的氧化。與苯甲酸結(jié)構(gòu)相近的水楊酸近來也發(fā)現(xiàn)對(duì)酪氨酸酶有抑制作用。廈門大學(xué)的陳清西教授研究了十個(gè)包括水楊酸在內(nèi)的水楊酸家族化合物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4-甲基水楊酸的抑制活性最高，其IC50為1.65mmol。其抑制活性大小的排序?yàn)椋?-甲基水楊酸〉5-甲基水楊酸〉4-甲氧基水楊酸〉水楊酸。

構(gòu)效關(guān)系的研究表明當(dāng)水楊酸的苯環(huán)上4位有甲基或甲氧基取代時(shí)，其抑制酪氨酸酶的能力就增加；同時(shí)，烷基取代位置的不同，可導(dǎo)致化合物抑制類型發(fā)生改變：當(dāng)烷基在鄰位和間位取代時(shí)，化合物的抑制類型是混合型的；而當(dāng)烷基取代基團(tuán)在羧基的對(duì)位時(shí)，化合物是酪氨酸酶的反競爭型抑制劑；而4-烷基取代苯甲酸化合物隨著對(duì)位烷基碳鏈長度的增加，該類化合物對(duì)酪氨酸酶的抑制活性增強(qiáng)，當(dāng)取代烷基碳鏈長度為8個(gè)碳時(shí)，對(duì)酶的抑制活性最強(qiáng)[2]。

2.1.2.2 苯丙素類

1999年Kubo的研究小組又從新鮮的人參葉甲醇提取物中分離到對(duì)羥基肉桂酸（p-Coumaric acid）也是一個(gè)酪氨酸酶抑制劑，屬于混合型抑制，與苯甲酸一樣屬于類似氫醌的抑制劑。同時(shí)還從 T. michuacana var longifolia 的干燥花中分離到Methyl coumarate，與對(duì)羥基肉桂酸，肉桂酸（Cinnamic acid），對(duì)甲氧基桂皮酸（p-Methoxycinnamic acid），肉桂醛（Cinnamaldehyde）及對(duì)甲氧基肉桂醛（p-Methoxycinnamaldehyde）一起進(jìn)行研究，結(jié)果表明對(duì)甲氧基桂皮酸抑制作用最強(qiáng)，IC50為0.27mmol。構(gòu)效關(guān)系研究表明對(duì)位的羥基是抑制活性的關(guān)鍵基團(tuán)，這跟羥基苯甲酸的情況相同，當(dāng)羥基處在對(duì)位時(shí)，化合物抑制活性大大提高。

2.1.3

1，2-二苯乙烯類衍生物

從葡萄等植物中提取的白藜蘆醇，因其具有多種生物活性和藥理作用，如抗腫瘤、抗突變、抗炎、抗血栓、抗高血脂及抗脂質(zhì)過氧化等，因而在心血管疾病方面有很好的優(yōu)勢。而后又發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇對(duì)酪氨酸酶也有很強(qiáng)的抑制活性。很快從桑Morus alba分離出了氧化白藜蘆醇（Oxyresveratrol），其與白藜蘆醇的母核結(jié)構(gòu)都是1，2-二苯乙烯（Stilbene，芪）。白藜蘆醇的IC50為10.8mol，氧化白藜蘆醇的IC50低至1mol，均是很強(qiáng)的酪氨酸酶抑制劑。對(duì)它們的衍生物及多聚物的研究表明，在1，2-二苯乙烯衍生物的結(jié)構(gòu)核上取代基的性質(zhì)、位置、數(shù)目對(duì)酪氨酸酶的抑制強(qiáng)度有直接的關(guān)系；當(dāng)只有一個(gè)羥基取代基時(shí)，該羥基芪沒有抑制酪氨酸酶的活性；當(dāng)結(jié)構(gòu)中有兩個(gè)羥基時(shí)，對(duì)酪氨酸酶的抑制活性顯著增強(qiáng)；帶有羥基取代基的比帶有甲氧基的芪化合物抑制酪氨酸酶的活性更強(qiáng)；反式芪才有很強(qiáng)的抑制活性，而且化合物結(jié)構(gòu)中烯烴結(jié)構(gòu)的存在對(duì)于化合物抑制酪氨酸酶活性是必要的。

2.1.4 黃酮類

韓國學(xué)者篩選了10種朝鮮傳統(tǒng)的茶葉對(duì)酪氨酸酶的抑制作用，綠茶的作用最強(qiáng)，其活性最強(qiáng)的成分為（-）-表兒茶素-3-O-沒食子酸鹽（ECG）、（+）-沒食子酸兒茶素-3-0-沒食子酸鹽GCG和（-）-表沒食子酸兒茶素-3-O-沒食子酸鹽（EGCG）。所有的兒茶素沒食子酸鹽均具有活性點(diǎn)。研究表明抑制作用不僅是沒食子酸的部分，這些黃酮水解后游離的3-羥基對(duì)黃酮醇的螯合能力是必須的。但是，從苦參Sophora flavescens的根部甲醇提取物中提取出三個(gè)黃酮類化合物，這些黃酮類化合物甚至強(qiáng)于曲酸的抑制強(qiáng)度。這三個(gè)化合物sophoraflavanone G， kuraridin以及 kurarinone的黃酮母核上都有一個(gè)異戊二烯基，類似于間苯二酚的結(jié)構(gòu)，說明3-位不是黃酮類具有抑制活性所必須的，而間苯二酚的結(jié)構(gòu)對(duì)于該類化合物的抑制活性具有重要的影響。但是從Garcinia kola的種子中用高速逆流色譜分離得到的母核為biflavonoid型的5種黃酮，其中的GB-2是5個(gè)黃酮中對(duì)酪氨酸酶抑制活性最好的，其抑制活性也強(qiáng)于同等條件下測得的曲酸[3]。這也為重新認(rèn)識(shí)黃酮的構(gòu)效關(guān)系提供了依據(jù)。

2.1.5 皂苷類

這類成分是2006年才發(fā)現(xiàn)的對(duì)于酪氨酸酶有作用的成分。Mahmud等從Astragalus（leguminwseae，豆科）中分離得到八個(gè)環(huán)木菠蘿烷型甾體皂苷（cycloartane glycosides），以及從Bryoniq melanocarpa （Cucurbitaceae，葫蘆科）得到一個(gè)葫蘆烷型甾體皂苷及其苷元。九個(gè)化合物中的六個(gè)具有很好的酪氨酸酶抑制活性，其中以askendoside B（屬于環(huán)木菠蘿烷型甾體皂苷）的抑制活性最好，它的IC50為13.95？mol。他們也是第一個(gè)報(bào)道關(guān)于環(huán)木菠蘿烷型甾體皂苷酪氨酸酶活性的研究小組，于已發(fā)現(xiàn)的有酪氨酸酶活性的化合物相比，這些皂苷屬于全新的分子結(jié)構(gòu)。由于皂苷結(jié)構(gòu)復(fù)雜他們簡單探索了上述化合物的構(gòu)效關(guān)系，發(fā)現(xiàn)從Bryoniq melanocarpa得到的Bryoamaride相比其苷元（Cucurbitacin L）來說在對(duì)酪氨酸酶的影響上好的太多：Cucurbitacin L沒有明顯的活性，而Bryoamaride的IC50為85.01mol。其他八個(gè)化合物中五個(gè)與Cycloalpioside D的苷元骨架相同，總體說來都是糖配基越多，其抑制酪氨酸酶的活性越強(qiáng)。

2.1.6 其他

還有文獻(xiàn)報(bào)道，從石榴Punica granatum果皮中使用sephadex G100純化的多糖成分（含1%蛋白質(zhì)）有很好的抑制酪氨酸酶的活性，在濃度為10g/ml時(shí)可以抑制43%的酪氨酸酶。同時(shí)石榴多糖還有優(yōu)良的清除自由基活性。

2. 2 中藥提取物的酪氨酸酶抑制劑

近年來，很多中藥提取物被證明具有良好的抑制酪氨酸酶的作用。

徐鵬等考察了27味中藥醇提物對(duì)酪氨酸酶體外活性的影響，結(jié)果表明生藥濃度達(dá)到2mg/ml時(shí)，紅花、楊梅葉、黃芩和綠茶相對(duì)抗壞血酸（維生素C）的酪氨酸酶抑制率分別達(dá)到128.62%、83.64%、79.65%和66.48%。

甘草提取物對(duì)酪氨酸酶也有抑制作用，沈鈞等測得的物對(duì)單酚酶和雙酚酶均有一定的抑制作用。

高山紅景天，已經(jīng)證明具有良好的抗氧化藥效，對(duì)酪氨酸酶抑制呈可逆的非競爭性抑制，與其濃度呈線性關(guān)系，濃度為6.0g/l時(shí)抑制率達(dá)80%。

再如桂園新鮮果實(shí)的提取物 [4]，桂園種子的提取物抑制酪氨酸酶的半數(shù)抑制率值有約3mg/ml。以上還都具有良好的抗自由基的功效。

3.結(jié)語

這些研究開發(fā)了中藥的新用途及新的研究方向，也為人們提供了新的思路與著眼點(diǎn)去開發(fā)酪氨酸酶抑制劑。天然的酪氨酸酶抑制劑可能是一種替代目前應(yīng)用的非天然酪氨酸酶抑制劑的先導(dǎo)化合物的良好來源，從中藥中尋找天然抑制劑的研究將隨著醫(yī)藥、化工和食品工業(yè)等領(lǐng)域的發(fā)展而不斷深入。

參考文獻(xiàn)：

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[2] Xiao-Hong Huang a， Qing-Xi Chen b， Qin Wang b， Kang-Kang Song b， Jun Wang b， Li Sha a， Xiong Guan. Inhibition of the activity of mushroom tyrosinase by alkylbenzoic acids. Food Chemistry，2006， 94 ： 1–6

[3] Christopher Okunji， Slavko Komarnytsky， Georgie Fear， Alexander Poulev， David M.Ribnicky， Peter I.Awachie， Yoichiro Ito， Ilya Raskin. Preparative isolation and identification of tyrosinase inhibitors from the seeds of Garcinia kola by high-speed counter chromatography. Journal of Chromatography A， 2007，1151： 45-50

[4] Nuchanart Rangkadilok， Somkid Sitthimonchai， Luksamee Worasuttayangkurn， Chulabhorn Mahidol， Mathuros Ruchirawat， Jutamaad Satayavivad. Evaluation of free radical scavenging and antityrosinase activities of standardized longan fruit extract. Food and Chemical Toxicology，2007，45：328-336