HPLC法對(duì)冬蟲夏草和蛹蟲草中核苷酸類成分的分析

何帥

（臨清市食品藥品監(jiān)督管理局 山東 臨清 252600）

摘要：采用反相高效液相色譜法，以SHIMADZU C18（150mm×4.6mm I.D. ，5μm）為色譜柱；以緩沖鹽（KH2PO4-H3PO4）-甲醇（99.5：0.5）（pH3.75）體系為流動(dòng)相，在流速0.8mL/min，柱溫26°C，檢測(cè)波長(zhǎng)260nm，進(jìn)樣量20μL的條件下對(duì)上述兩個(gè)樣品中5′-核苷酸的含量進(jìn)行了分析測(cè)定。結(jié)論該法快速簡(jiǎn)便，重現(xiàn)性好，能有效的測(cè)定樣品中核苷酸類成分。

關(guān)鍵詞：5′-核苷酸；冬蟲夏草；蛹蟲草菌絲體；高效液相色譜

【中圖分類號(hào)】R914.1 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1002-

3763（2014）02-0003-01

核酸是生命科學(xué)中重要的復(fù)雜的生物大分子。核酸組成的分析促進(jìn)了生物化學(xué)的迅速發(fā)展，因此越來(lái)越引起人們的重視?，F(xiàn)代藥理研究表明，冬蟲夏草及其活性成分對(duì)免疫系統(tǒng)有雙向調(diào)節(jié)作用，對(duì)腎臟和肝臟疾病有治療作用，并有抗腫瘤、抗衰老和抗應(yīng)激的活性[1]。蛹蟲草是一種與冬蟲夏草藥理作用相近的藥材，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力及抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。在含量上有些成分含量高于冬蟲夏草。

本文主要測(cè)定冬蟲夏草、蛹蟲草菌絲體中的5′-核苷酸。應(yīng)用反相高效液相色譜系統(tǒng)測(cè)定上述兩種樣品中的核苷酸類物質(zhì)。

1材料與方法

色譜甲醇（山東禹王試劑廠）、磷酸鹽緩沖液（pH=3.75，濃度0.2mol？L-1）、超純水；對(duì)照品5′-AMP（5′-腺苷酸）、5′-CMP（5′-胞苷酸）、5′-GMP（5′-鳥苷酸）、5′-UMP（5′-尿苷酸）、5′-IMP（5′-嘌呤核苷酸）、5′-XMP（5′-黃嘌呤核苷酸）均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。

分別取6種標(biāo)準(zhǔn)品，精密稱定后，置于容量瓶，定容，然后稀釋成一定濃度的對(duì)照品溶液。

混合標(biāo)準(zhǔn)品的配制：5′-UMP、5′-GMP、5′-AMP、5′-CMP、5′-IMP、5′-XMP濃度分別為0.0210，0.0152，0.0152，0.0160，0.0260和0.0194g·L-1。

安捷倫高效液相色譜儀（Agilent 1100 HPLC， America）；色譜柱：SHIMADZU C18（150mm×4.6mm I.D.， 5μm）；流動(dòng)相：緩沖鹽（KH2PO4-H3PO4）-甲醇（99.5：0.5）（pH3.75）體系；流速：0.8mL/min；柱溫：26℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：260nm；進(jìn)樣量：20μL。

樣品：冬蟲夏草（購(gòu)自西藏自治區(qū)藥材公司）；蛹蟲草菌絲體（北京大學(xué)生命學(xué)院菌種室提供）。

樣品的制備：分別稱取上述四種樣品各0.500g，加10mL水，超聲粉碎，在4200r·min-1下離心20min。取上清液，用0.45μm濾膜過(guò)濾。

超聲粉碎條件：JY92-Ⅱ型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，超聲5s鐘，間歇5s，工作60次，重復(fù)1次，共計(jì)20 min。

用標(biāo)準(zhǔn)加入法對(duì)對(duì)照品中各色譜組分進(jìn)行色譜分析，六種組分依次為： 5′-CMP；5′-UMP；5′-GMP；5′-IMP；5′-XMP；5′-AMP。

2 方法學(xué)考察

精密吸取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液2，4，6，8和10mL，分別置于50mL量瓶中，用超純水定容。在上述色譜條件下進(jìn)樣20μL，測(cè)定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，由標(biāo)準(zhǔn)曲線可知：六種對(duì)照品分別在8.2～42.2，6.0～31.5，5.8～30.9，6.2～33.0，7.1～38.4和7.5～41.5mg·L-1范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，經(jīng)日內(nèi)兩次重復(fù)，相關(guān)系數(shù)均在0.998以上。

表明此標(biāo)準(zhǔn)混合工作液，在冷藏的條件下，至少4日內(nèi)其濃度基本不變。

稱對(duì)照品一份，按上述方法制備供試液，于相同色譜條件及進(jìn)樣量下測(cè)定峰面積，一日內(nèi)每4h測(cè)定1次，連續(xù)測(cè)定5次。將每個(gè)對(duì)照品當(dāng)日測(cè)定的5次的峰面積的平均值，及各次的峰面積積分結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，RSD分別為2.34%，2.51%，2.48%，2.08%，2.10%和2.02%（n=5）。

稱取對(duì)照品5份，每份0.1g，按對(duì)照品制備方法制備供試液，分別在相同色譜條件和進(jìn)樣量下測(cè)定峰面積，將每個(gè)對(duì)照品測(cè)定的5次的峰面積的平均值，及各次的峰面積積分結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)， RSD分別為2.09%，2.23%，2.10%，2.52%，2.05%和2.11%（n=5）。

結(jié)果表明樣品供試品溶液在8h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1冬蟲夏草

取約0.25g已知含量的樣品，精密稱定。精密加入已知量的對(duì)照品適量，按樣品條件進(jìn)樣測(cè)定。

取已經(jīng)處理好的樣品于高效液相色譜儀配備的樣品瓶中，按最佳色譜條件進(jìn)樣。

用標(biāo)準(zhǔn)加入法對(duì)各核苷酸類組分進(jìn)行定性，然后用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品中所含各種核苷酸的含量分別為：5′-UMP 886.0μg·g-1、5′-GMP 11.1μg·g-1、5′-IMP 1640.4μg·g-1、 5′-AMP 153.7μg·g-1。

2.2蛹蟲草菌絲體

取約0.25g已知含量的樣品，精密稱定。精密加入已知量的對(duì)照品適量，按樣品條件進(jìn)樣測(cè)定。

用標(biāo)準(zhǔn)加入法對(duì)各核苷酸類組分進(jìn)行定性，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品中所含各種核苷酸的含量分別為：

5′-CMP 173.0μg·g-1、 5′-UMP 824.9μg·g-1、5′-GMP 92.9μg·g-1、5′-IMP 2114.0μg·g-1、5′-XMP 79.6μg·g-1、5′-AMP 231.4μg·g-1。

3 結(jié)論

經(jīng)測(cè)定冬蟲夏草有4種核苷酸，每克含量為：5′-UMP 886.0μg、5′-GMP 11.1μg、5′-IMP 1640.4μg、 5′-AMP 153.7μg ；蛹蟲草菌絲體有6種核苷酸，每克含量為：5′-CMP 173.0μg、 5′-UMP 824.9μg、5′-GMP 92.9μg、5′-IMP 2114.0 μg、5′-XMP 79.6 μg、5′-AMP231.4 μg 。

冬蟲夏草和蛹蟲草菌絲體中5′-UMP 、5′-IMP 含量均較高。

本文用反相高效液相色譜法對(duì)兩種樣品中的核苷酸類物質(zhì)進(jìn)行定性、定量分析，快速、簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性好，為進(jìn)一步開發(fā)利用蟲草等珍貴藥材提供了理論數(shù)據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]郭海平，楊智敏.冬蟲夏草藥理作用研究進(jìn)展[J].中草藥，1999，30（3）：231-233.