枇杷果實(shí)發(fā)育過(guò)程中山梨醇含量及相關(guān)酶活性的變化

吳錦程等

摘 要 以果型和品質(zhì)差異較大的黃肉枇杷（Eriobotrya japonica Lindl.）‘解放鐘和白肉枇杷‘白梨的果實(shí)為試材，測(cè)定果實(shí)發(fā)育過(guò)程中山梨醇、果糖、葡萄糖含量及與山梨醇代謝相關(guān)酶--山梨醇脫氫酶（Sorbitol dehydrogenase， SDH）和山梨醇氧化酶（Sorbitol oxidase， SOX）活性的變化，并探討山梨醇代謝與枇杷果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育和品質(zhì)形成的關(guān)系。結(jié)果表明：2個(gè)枇杷品種果實(shí)中山梨醇含量均隨果實(shí)發(fā)育進(jìn)程呈下降趨勢(shì)，且‘白梨枇杷果實(shí)中山梨醇含量高于‘解放鐘。在花后35～80 d，2個(gè)枇杷品種幼果中葡萄糖和果糖含量均較低且相對(duì)穩(wěn)定，而花后95～140 d果實(shí)中葡萄糖和果糖含量逐漸上升，并在花后125～140 d果實(shí)成熟期急劇增加而達(dá)到峰值；果實(shí)中葡萄糖含量在2個(gè)品種間差異不顯著（p>0.05），花后125～140 d的果實(shí)成熟期，‘白梨果實(shí)中果糖含量顯著高于‘解放鐘（p<0.05）。果實(shí)發(fā)育過(guò)程中SDH和SOX的活性均呈先降后升的變化趨勢(shì)。說(shuō)明2個(gè)枇杷品種果實(shí)發(fā)育過(guò)程中山梨醇、果糖、葡萄糖含量及SDH和山SOX的活性表現(xiàn)出相似的變化規(guī)律，但果實(shí)山梨醇含量與SDH和SOX的活性在果實(shí)膨大期均存在顯著差異（p<0.05），這可能是黃肉枇杷與白肉枇杷品質(zhì)差異的關(guān)鍵。

關(guān)鍵詞 枇杷；山梨醇；山梨醇脫氫酶；山梨醇氧化酶

中圖分類號(hào) S667.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract The changes of sorbitol， fructose and glucose contents and the activities of sorbitol-metabolizing enzymes， including sorbitol dehydrogenase（SDH）， sorbitol oxidase（SOX）were studied during the fruit development of ‘Baili and ‘Jiefangzhongcultivars of loquat（Eriobotrya japonica Lindl.）. The study was carried out to explore the relationships between sorbitol metabolism and the growth， development and quality formation of loquat fruits. The results showed that sorbitol content in the two cultivars generally decreased during fruit development， and sorbitol content was higher in ‘Baili than in ‘Jiefangzhong loquat. In the two cultivars， young loquat fruits from 35 to 80 days after anthesis exhibited low and relatively stable contents of fructose and glucose； their contents increased gradually from 95 to 140 days after anthesis， reaching to a peak from 125 to 140 days after anthesis. The glucose contents in the developing loquat fruits were similar in the two cultivars（p>0.05）. The fructose content of ‘Baili fruit was significantly higher than that of ‘Jiefangzhong fruit during fruit maturation（p<0.05）. In both cultivars， the activities of SDH and SOX decreased at first， and then rised during loquat fruit development. Trends of sorbitol， fructose and glucose contents and SDH， SOX activities were similar in the two cultivars， except for sorbitol content and SDH， SOX activities at the stage of loquat fruit enlargement（p<0.05）. This may be the key for the formation of fruit quality in the two different loquat cultivars with yellow and white pulp.

Key words Loquat；Sorbitol；Sorbitol dehydrogenase（SDH）；Sorbitol oxidase（SOX）

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.10.019

枇杷（Eriobotrya japonica Lindl.）是薔薇科（Rosaceae）蘋果亞科（Maloideae）枇杷屬的一種常綠果樹(shù)，是原產(chǎn)中國(guó)南方的特有珍稀水果。枇杷依其果肉顏色可分為黃肉枇杷和白肉枇杷2類，黃肉枇杷果實(shí)相對(duì)較大，但品質(zhì)不及白肉枇杷；白肉枇杷果實(shí)味甜爽口、品質(zhì)極優(yōu)，但果較小。山梨醇屬于糖醇類，是山梨糖的還原產(chǎn)物[1]。山梨醇在高等植物中多集中分布于薔薇科的蘋果亞科、梅亞科、繡線菊亞科和薔薇亞科的棣棠花屬、下田菊屬和多瓣木屬，而其它植物山梨醇含量極低或不含[2]。相關(guān)研究認(rèn)為，果實(shí)中山梨醇并不始終以山梨醇的形式存在，可通過(guò)其代謝酶而被轉(zhuǎn)化為果糖和葡萄糖，從而促進(jìn)果實(shí)的膨大和品質(zhì)的形成[3-5]。單守明等[6]的研究結(jié)果表明，外源激素通過(guò)調(diào)控SDH和SOX的活性而對(duì)蘋果果實(shí)生長(zhǎng)速率及品質(zhì)的形成產(chǎn)生影響。安永梅等[7]研究認(rèn)為蘋果套袋降低了果實(shí)山梨醇的轉(zhuǎn)化能力，從而改變果實(shí)的品質(zhì)。孟海玲等[8]研究認(rèn)為山梨醇吸收量和代謝能力的增強(qiáng)能促進(jìn)桃果實(shí)體積和重量的迅速增加。目前，有關(guān)果實(shí)發(fā)育過(guò)程中山梨醇及相關(guān)酶活性變化的研究多集中在薔薇科的蘋果、桃子、梨等果樹(shù)，而枇杷果實(shí)發(fā)育過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)成分及相關(guān)酶活性變化的研究主要集中于蔗糖及相關(guān)酶活性，有關(guān)枇杷果實(shí)山梨醇及代謝相關(guān)酶的研究鮮有報(bào)道。本研究以果型和品質(zhì)差異較大的黃肉枇杷‘解放鐘（大果型）和白肉枇杷‘白梨（小果型）的果實(shí)為材料，分析果實(shí)發(fā)育過(guò)程中山梨醇、果糖、葡萄糖含量及山梨醇代謝相關(guān)酶活性的變化規(guī)律，旨在為進(jìn)一步探索枇杷果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育及糖積累與轉(zhuǎn)化的調(diào)控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以果型和品質(zhì)差異較大的‘解放鐘和‘白梨枇杷果實(shí)為試材，由福建省莆田市果樹(shù)研究所提供。選取8年生樹(shù)冠大小和長(zhǎng)勢(shì)相對(duì)一致、無(wú)病蟲(chóng)害、生長(zhǎng)正常的枇杷樹(shù)15株掛牌標(biāo)記（經(jīng)常規(guī)疏果），采取統(tǒng)一的土、肥、水管理方案，按物候期自花后35 d起至果實(shí)成熟，每隔15 d定期于樹(shù)冠外圍東、南、西、北和頂部隨機(jī)選取中等大小果實(shí)15～20個(gè)，采用隔熱保溫箱冰凍密封，并迅速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，液氮速凍后保存于-70 ℃超低溫冰箱，待測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

1.2 方法

1.2.1 山梨醇的提取與測(cè)定 果實(shí)山梨醇的提取參照陳俊偉等[9]和孟艷玲等[10]的方法并稍作修改。用液氮將果實(shí)研磨成粉末過(guò)篩后，稱2.0～3.0 g粉末樣品，加入10.0 mL 80%乙醇于80 ℃水浴中提取10 min，以2 500×g離心10 min并收集上清液，其沉淀再用80%乙醇提取2次，合并上清液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮，加2.0 mL雙蒸水定溶，再用Sep-Pak C18柱進(jìn)行固相萃取以除去色素、多酚與脂類，然后用0.22 μm濾膜進(jìn)行除菌過(guò)濾，最后獲得山梨醇待測(cè)樣液。

山梨醇含量的測(cè)定參照孟艷玲等[10]和張麗娟等[11]的方法并稍作修改，采用液相色譜儀Waters 209系統(tǒng)，泵Waters 510，色譜柱為SUGAR SC1011（Shodex，日本）（8 mm i. d.×300 mm），以超純水為流動(dòng)相，0.8 mL/min的流量，紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為190 nm， 柱溫為25 ℃，進(jìn)樣量為20.0 μL。

1.2.2 糖的提取與測(cè)定 果糖和葡萄糖的提取與測(cè)定參照張友杰[12]的方法，果糖和葡萄糖含量以mg/g FW表示。

1.2.3 酶液制備與活性測(cè)定 酶液制備參照單守明等[6]的方法并稍作修改。稱取1.0 g果肉于研缽內(nèi)，加少量石英砂和HEPES提取緩沖液5.0 mL（50.0 mmol/L的HEPES-NaOH，pH7.5，含10.0 mmol/L的MgCl2，1.0 mmol/L的EDTA，2. 5 mmol/L的DTT，10.0 mmol/L的維生素C和5.0%不溶性PVPP），冰浴研磨勻漿，于4 ℃條件下經(jīng)12 000×g離心20 min，上清液即為粗酶液。粗酶液經(jīng)45%～75%飽和度的硫酸銨分級(jí)鹽析，鹽析后采用稀釋10倍的HEPES提取緩沖液（不含PVPP）于4 ℃下透析15 h，得到的酶液保存于4 ℃冰箱中待測(cè)酶活性。SDH和SOX的活性測(cè)定參照Yamaki[13]和任雪峰等[14]的方法并稍作修改，以μmol NADH/h·g FW表示SDH的活性，以μmol glucose/（h·g FW）表示SOX的活性。

1.3 數(shù)據(jù)分析

以上各指標(biāo)的測(cè)定均重復(fù)3次，取平均值。所得數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel軟件進(jìn)行繪圖，采用SPSS軟件檢驗(yàn)差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 枇杷果實(shí)發(fā)育過(guò)程中山梨醇含量的變化

從圖1可看出，枇杷果實(shí)中山梨醇含量相對(duì)較低。‘解放鐘枇杷果實(shí)山梨醇含量隨果實(shí)發(fā)育進(jìn)程而降低，在花后35～95 d的果實(shí)生長(zhǎng)期，果實(shí)山梨醇含量呈快速下降，而果實(shí)發(fā)育后期即果實(shí)趨向成熟，果實(shí)山梨醇含量下降速度趨向平緩?！桌骅凌斯麑?shí)山梨醇含量隨果實(shí)發(fā)育進(jìn)程呈降-升-降-升的變化規(guī)律，致使其果實(shí)山梨醇含量在花后65～95 d的果實(shí)膨大期和125～140 d的成熟期顯著高于‘解放鐘，差異達(dá)顯著水平（p<0.05）。但‘白梨枇杷果實(shí)山梨醇含量隨果實(shí)發(fā)育進(jìn)程總體上呈下降趨勢(shì)，表現(xiàn)出與‘解放鐘枇杷相似的變化趨勢(shì)。在果實(shí)發(fā)育進(jìn)程中，‘白梨果實(shí)山梨醇含量總體上高于‘解放鐘。

2.2 枇杷果實(shí)發(fā)育過(guò)程中葡萄糖含量的變化

由圖2可見(jiàn)，‘白梨和‘解放鐘枇杷果實(shí)發(fā)育過(guò)程中葡萄糖含量均呈上升的變化趨勢(shì)，其中在花后35～95 d的果實(shí)生長(zhǎng)期，2個(gè)枇杷品種果實(shí)的葡萄糖含量較低且相對(duì)穩(wěn)定，而花后125～140 d的果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育后期，果實(shí)葡萄糖含量急劇上升并達(dá)到峰值，葡萄糖含量的變化與枇杷果實(shí)發(fā)育過(guò)程中甜度逐漸增加的品質(zhì)變化進(jìn)程相吻合?！桌婧汀夥喷婅凌嗽诠麑?shí)發(fā)育過(guò)程中葡萄糖含量差異不顯著（p>0.05），2個(gè)枇杷品種果實(shí)品質(zhì)存在差異的原因不在于葡萄糖。

2.3 枇杷果實(shí)發(fā)育過(guò)程中果糖含量的變化

從圖3可以看出，‘白梨和‘解放鐘果實(shí)發(fā)育過(guò)程中果糖含量均呈增加的變化趨勢(shì)，在花后35～80 d，果實(shí)中果糖含量一直保持在較低的水平，花后80～110 d果實(shí)中果糖含量開(kāi)始平緩上升，而花后125～140 d果實(shí)中果糖含量急劇增加并達(dá)到峰值，90%以上的果糖是在果實(shí)成熟前30 d內(nèi)積累的。在花后35～125 d，‘白梨和‘解放鐘枇杷果實(shí)中果糖含量相近，兩者差異未達(dá)顯著水平（p>0.05），但在花后125～140 d，‘白梨枇杷果實(shí)中果糖含量顯著高于‘解放鐘（p<0.05）；至果實(shí)成熟時(shí)，‘白梨枇杷果實(shí)中果糖含量是‘解放鐘的2倍多，差異達(dá)極顯著水平（p<0.01）。這可能是導(dǎo)致黃肉枇杷果實(shí)品質(zhì)不及白肉枇杷的重要原因之一。

2.4 枇杷果實(shí)發(fā)育過(guò)程中SDH活性的變化

SDH在果實(shí)中催化山梨醇轉(zhuǎn)變成果糖和葡萄糖。從圖4可看出，‘白梨果實(shí)發(fā)育過(guò)程中SDH活性變化不同于‘解放鐘，‘白梨枇杷果實(shí)SDH活性呈“升-降-升”的變化規(guī)律，而‘解放鐘枇杷果實(shí)SDH活性則呈“先降-后升”的變化趨勢(shì)。在花后50～95 d， ‘解放鐘枇杷果實(shí)SDH活性明顯高于‘白梨，差異達(dá)顯著水平（p<0.05）。在花后110～140 d即果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育后期，因‘白梨枇杷果實(shí)SDH活性上升較快，導(dǎo)致‘白梨枇杷果實(shí)SDH活性高于‘解放鐘，兩者差異達(dá)顯著水平（p<0.05），這與‘白梨枇杷果實(shí)果糖含量高于‘解放鐘枇杷的結(jié)果相一致。在花后125～140 d，2個(gè)枇杷品種果實(shí)的SDH活性均表現(xiàn)出急劇上升。

SOX在果實(shí)中催化山梨醇轉(zhuǎn)變成葡萄糖。從圖5可看出，‘白梨和‘解放鐘枇杷果實(shí)發(fā)育過(guò)程中SOX活性均呈“先降-后升”的變化趨勢(shì)，但‘白梨枇杷果實(shí)SOX活性下降較為平緩，而‘解放鐘枇杷果實(shí)SOX活性下降較為明顯，并由此導(dǎo)致在花后35～80 d，‘白梨枇杷果實(shí)SOX活性高于‘解放鐘，特別在花后50～80 d期間，兩者差異達(dá)顯著水平（p<0.05）。在花后80～140 d，2個(gè)枇杷品種果實(shí)SOX活性逐漸上升，但兩者SOX活性差異不明顯（p>0.05），這與果實(shí)成熟時(shí)‘白梨枇杷果實(shí)葡萄糖含量略高于‘解放鐘枇杷的結(jié)果相吻合。

3 討論與結(jié)論

山梨醇是薔薇科果樹(shù)枇杷同化物的主要運(yùn)輸形式，參與果實(shí)的形態(tài)建成及糖代謝，影響果實(shí)的生長(zhǎng)發(fā)育與品質(zhì)的形成[9]。枇杷果實(shí)發(fā)育早期生長(zhǎng)較慢，且葡萄糖和果糖含量較低，可能與山梨醇作為代謝基質(zhì)用于呼吸代謝、細(xì)胞分裂和細(xì)胞形成等消耗較少，同時(shí)山梨醇被轉(zhuǎn)化成葡萄糖和果糖也較少有關(guān)；而葉片合成的山梨醇不斷外運(yùn)到果實(shí)中，使發(fā)育早期枇杷果實(shí)山梨醇含量保持在較高的水平。隨著果實(shí)進(jìn)入細(xì)胞快速分裂和生長(zhǎng)的發(fā)育中期，用于形態(tài)建成的山梨醇消耗隨之增加，導(dǎo)致此時(shí)果實(shí)山梨醇含量的降低。果實(shí)發(fā)育后期，SDH和SOX的活性隨著果實(shí)的成熟而逐漸升高，果實(shí)葡萄糖和果糖含量也隨之增加，葉片轉(zhuǎn)運(yùn)來(lái)的山梨醇可能大部分被轉(zhuǎn)化成葡萄糖和果糖，因此成熟果實(shí)中山梨醇含量很低。在枇杷果實(shí)發(fā)育過(guò)程中，由山梨醇在果實(shí)發(fā)育早期和中期主要用于形態(tài)建成逐漸向果實(shí)發(fā)育后期山梨醇被轉(zhuǎn)化的功能轉(zhuǎn)變。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)果實(shí)成熟時(shí)，供試白肉枇杷‘白梨果實(shí)的果糖含量是‘解放鐘的2倍多，其山梨醇含量也高于‘解放鐘，而葡萄糖含量無(wú)明顯差別。在枇杷果實(shí)的葡萄糖、果糖和蔗糖3種糖中，果糖的甜度最高，白肉枇杷果實(shí)品質(zhì)優(yōu)于黃肉枇杷與其高果糖含量相關(guān)，這與陳俊偉等[9]的研究結(jié)果一致。

本研究結(jié)果表明，在果實(shí)發(fā)育的早期和中期即花后50～95 d，‘解放鐘枇杷果實(shí)SDH的活性雖明顯高于‘白梨，而此期間‘解放鐘和‘白梨的果糖含量卻維持在較低的水平且，兩者幾乎無(wú)差異。果實(shí)發(fā)育后期即花后110～125 d，‘白梨枇杷果實(shí)SDH的活性高于‘解放鐘，而這期間‘白梨的果糖含量極顯著高于‘解放鐘，這表明枇杷果實(shí)中果糖含量還受控于其它代謝途徑，這與Sizuki等[15]在蘋果與亞洲梨上的研究結(jié)果基本一致。

Loescher等[16]和Archbold[17]研究認(rèn)為蘋果果實(shí)的生長(zhǎng)速率取決于果實(shí)獲取山梨醇的能力及山梨醇的轉(zhuǎn)化效率，SDH和SOX對(duì)果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育和品質(zhì)的形成起調(diào)控作用[4， 17]。本試驗(yàn)在花后65～95 d的果實(shí)細(xì)胞快速分裂和生長(zhǎng)期，‘白梨枇杷果實(shí)山梨醇的含量顯著高于‘解放鐘，而果實(shí)中果糖和葡萄糖含量卻沒(méi)有明顯變化且維持在較低的水平；這一時(shí)期‘白梨果實(shí)細(xì)胞分裂和細(xì)胞生長(zhǎng)速度慢于‘解放鐘，可能與其果實(shí)山梨醇用于細(xì)胞分裂與生長(zhǎng)等形態(tài)建成的轉(zhuǎn)化能力較弱或轉(zhuǎn)化為果糖和葡萄糖的需求少于‘解放鐘相關(guān)，導(dǎo)致其山梨醇的積累量高于‘解放鐘的結(jié)果，從而影響果實(shí)體積和重量的迅速增加，這可能是白肉枇杷果型普遍比黃肉枇杷果型小的原因之一。

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