霍山石斛HMGR基因的克隆及其定量表達(dá)分析

林榕燕 賴鐘雄

摘 要 獲得甲羥戊酸生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因——3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因的信息是確定該基因與倍半萜類石斛堿含量相關(guān)性的重要基礎(chǔ)工作。本研究采用RT-PCR結(jié)合RACE技術(shù)，以霍山石斛原球莖為材料，克隆得到霍山石斛HMGR基因的全長cDNA序列，其在GenBank中的登錄號為KF011508。HMGR基因全長2 240 bp，包含144 bp的5′-UTR，407 bp的3′-UTR（含poly A），開放閱讀框?yàn)? 689 bp，共編碼562個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析表明：該蛋白可能是定位于細(xì)胞質(zhì)的一種疏水性不穩(wěn)定蛋白，無信號肽，不含卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，具有14個(gè)功能位點(diǎn)、27個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其二級結(jié)構(gòu)由α螺旋、β折疊和無規(guī)則卷曲組成。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，該基因與黃姜HMGR基因親緣關(guān)系最近，聚為同一類，主要負(fù)責(zé)催化萜類化合物生物合成途徑中的輔酶A和甲羥戊酸的生成。qPCR結(jié)果顯示：霍山石斛HMGR基因在莖中的表達(dá)量最高，而根中的表達(dá)量最低。

關(guān)鍵詞 霍山石斛（Dendrobium huoshanense）；HMGR基因；克隆；生物信息學(xué)分析

中圖分類號 S682.31 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract Obtaining the information of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase（HMGR）gene， a key enzyme gene of the mevalonate biosynthetic pathway， is the basis in studying the relationship between this gene and sesquiterpenoids alkaloids. In this experiment， the full-length cDNA of the HMGR gene was successfully cloned from the protocorm of Dendrobium huoshanense by RT-PCR combined RACE.The accession number（KF011508）of this gene has been registered in GenBank. The full-length of HMGR gene is 2 240 bp， containing 144 bp 5′-UTR， 407 bp 3′-UTR（including poly A）and a 1 689 bp open reading frame， which encoding 562 amino acids. Bioinformatics analysis showed that the protein is likely a kind of hydrophobicity and unstable protein located in the cytoplasm. This protein has 14 functional sites and 27 phosphorylation sites， but has no signal peptide and coil helix structures. The secondary structure was constituted by α- helix， β- folding and random coil. The phylogenetic tree analysis showed that this gene has the closest relationship with HMGR of Dioscorea zingiberensis，which is mainly catalytic the produce of coenzyme A and mevalonate in the terpenoid biosynthetic pathway. qPCR results showed that the expression level of HMGR gene from Dendrobium huoshanense was highest in stem while lowest in root.

Key words Dendrobium huoshanense； HMGR genes； Cloning； Bioinformatics analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.10.016

霍山石斛（Dendrobium huoshanense）屬蘭科石斛屬多年生草本植物，產(chǎn)于安徽省霍山縣，是國家重點(diǎn)保護(hù)的傳統(tǒng)名貴藥用植物[1]，也是歷代本草中記述最多、最為詳盡的一種石斛?；羯绞幱脙r(jià)值極高，功效奇特，資源稀少，價(jià)格昂貴，素有“中華仙草之最”的美稱[2]，其應(yīng)用范圍正迅速擴(kuò)大，需求量不斷增加，是眾多保健藥品和保健食品的主要原料之一[3-5]。但是霍山石斛對生長條件要求十分苛刻，加上人工過度采挖，其野生資源已瀕臨滅絕[6]。石斛屬植物中的倍半萜類生物堿是其主要有效成分之一，但含量一般較低[7]，因此通過基因工程手段提高倍半萜類生物堿的含量具有重大意義。

植物萜類化合物合成主要通過甲羥戊酸（MVA）途徑和脫氧木酮糖-5-磷酸（DXP）途徑，在這2種途徑中，異戊二烯焦磷酸（IPP）是主要中間產(chǎn)物，由其生成單萜、倍半萜、二萜、三萜等化合物[8]。3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGR）是甲羥戊酸（MVA）途徑中的限速酶[9]，能夠在甲羥戊酸途徑中催化3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（HMG-CoA）生成甲羥戊酸。目前，HMGR已經(jīng)從馬鈴薯、紅豆杉、橡膠樹等多種植物中克隆出來[10-13]。大量研究表明，HMGR也是甲羥戊酸途徑中的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)控位點(diǎn)，在植物萜類的生物合成方面具有重要的調(diào)控作用。將長春花HMGR基因轉(zhuǎn)到青蒿中，可以使青蒿中的青蒿素含量顯著提高[14]。在煙草中超表達(dá)陽春砂的HMGR基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單萜、倍半萜、二萜、甾醇及植醇的總含量都提高了[15]。但目前還未有HMGR基因從霍山石斛中克隆得到的相關(guān)報(bào)道。

本研究從倍半萜類生物堿生物合成途徑出發(fā)，采用RT-PCR結(jié)合RACE技術(shù)克隆得到霍山石斛倍半萜類生物堿生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因（HMGR）的全長cDNA，并進(jìn)行生物信息學(xué)和定量表達(dá)分析，希望為后續(xù)霍山石斛HMGR基因的功能驗(yàn)證以及倍半萜類生物堿合成代謝工程改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為霍山石斛原球莖，由福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所提供。將試驗(yàn)材料放于繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)50 d后，取生長旺盛的原球莖為材料進(jìn)行試驗(yàn)。繼代培養(yǎng)基的配方為1/2 MS+0.5 mg/L 6-BA，其中蔗糖20.0 g/L，瓊脂粉6.0 g/L，pH值5.7，溫度（25±2）℃，光照時(shí)間12 h/d，光照強(qiáng)度1 200～2 000 lx。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 霍山石斛原球莖RNA的提取及cDNA的合成

采用Tripure法[16]進(jìn)行霍山石斛原球莖總RNA的提取，提取得到的總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，經(jīng)分光光度計(jì)檢測其純度。而后直接用于cDNA第一鏈的合成或置于-80 ℃條件下保存?zhèn)溆?。保守區(qū)擴(kuò)增、3′RACE以及開放閱讀框（ORF）驗(yàn)證過程中所用的cDNA的合成都是采用RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas）試劑盒，5′RACE 所需cDNA的合成采用System for Rapid Amplification of cDNA Ends，Version 2.0的試劑盒進(jìn)行，產(chǎn)物均置于-20 ℃保存。

1.2.2 霍山石斛HMGR基因的引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增 從NCBI上下載與霍山石斛相關(guān)的HMGR基因序列，根據(jù)同源克隆的原則設(shè)計(jì)基因保守區(qū)的上下游引物。根據(jù)HMGR基因保守區(qū)的測序結(jié)果設(shè)計(jì)3′RACE的2條正向特異引物以及5′RACE的2條反向特異引物。將獲得的目的基因的5′RACE序列、ORF驗(yàn)證序列及3′RACE序列采用DNAMAN 軟件進(jìn)行拼接，得到該基因的cDNA全長，并在ORF外或起始密碼子和終止密碼子處分別設(shè)計(jì)一對引物用于ORF的擴(kuò)增。本研究所用的引物見表1。

以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性 4 min；94 ℃變性 45 s，退火45 s，72 ℃延伸1 min/kb；共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，10 ℃保持1 h。各環(huán)節(jié)的退火溫度及延伸時(shí)間見表1。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過瓊脂糖（1%）電泳進(jìn)行檢測。采用DNA快速純化回收試劑盒（Solarbio）回收目的片段，以pMD-18T（TaKaRa）連接載體，Escherichia coli（DH5α）感受態(tài)（TianGen）對回收片段進(jìn)行連接、克隆和轉(zhuǎn)化。陽性克隆子送上海博尚生物公司測序完成。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 利用在線ExPASy（http：//www.expasy.org/resources/）蛋白分析軟件ProtParam、ProtScale、COIL、SWISS-MODEL對蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析和卷曲結(jié)構(gòu)、三維結(jié)構(gòu)預(yù)測；利用在線CBS Prediction Servers蛋白分析軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/）中的SignalP、TMHMM、NetPhos對蛋白進(jìn)行信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測和磷酸化位點(diǎn)分析；利用http：//psort.hgc.jp/form.html進(jìn)行亞細(xì)胞定位；利用NCBI的Conserved Donain Search在線軟件（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）進(jìn)行蛋白保守結(jié)構(gòu)域的預(yù)測；利用PredictProtein（http：//www.predictprotein.org/）對該蛋白的功能位點(diǎn)和二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測；并利用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4 霍山石斛不同組織材料的HMGR基因定量表達(dá)分析 本研究以18S rRNA為內(nèi)參基因，檢測目的基因HMGR在霍山石斛試管苗不同組織中的相對表達(dá)量。采用Takara SYBR ExScript試劑和羅氏LightCycler480儀器，以霍山石斛的老葉、幼葉、根和莖稀釋后的cDNA作為模板，HMGR-F和HMGR-R作為上下游引物進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，具體操作流程參照吳高杰[16]的研究。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行溶解曲線、擴(kuò)增曲線等的分析，檢測引物的特異性。在樣品擴(kuò)增反應(yīng)前先以試驗(yàn)中不同cDNA模板的混合樣不同稀釋倍數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作，以上每個(gè)反應(yīng)包括3個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 霍山石斛原球莖總RNA的提取

提取得到的霍山石斛原球莖總RNA，其A260/A280值在2左右，A260/A230值大于2，質(zhì)量較好，28 S rRNA和18 S rRNA條帶都較清晰，且28 S rRNA條帶亮度約為18 S rRNA 2倍。RNA在-80 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 霍山石斛原球莖HMGR基因cDNA全長序列的獲得

以反轉(zhuǎn)錄合成的保守區(qū)cDNA 第一鏈為模板，采用相應(yīng)的引物擴(kuò)增得到約544 bp 的特異性條帶，經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫比對，確定其為目的條帶。根據(jù)保守區(qū)序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行5′和3′擴(kuò)增，經(jīng)測序后分別得到1 048 bp和1 080 bp的目的條帶。將所獲得的HMGR基因的3′RACE、保守區(qū)序列和5′RACE序列進(jìn)行拼接，而后根據(jù)拼接的全長序列設(shè)計(jì)相應(yīng)的ORF驗(yàn)證引物，擴(kuò)增得到1 754 bp左右的特異性條帶，測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中在線進(jìn)行Blast，結(jié)果表明所得片段為霍山石斛HMGR基因序列。該cDNA全長2 240 bp，包含144 bp的5′UTR，一個(gè)完整的共1 689 bp的 ORF（145-1833），以及407 bp的3′UTR（含poly A）。該cDNA序列共編碼562個(gè)氨基酸，已登錄GenBank，登錄號為KF011508。

2.3 霍山石斛原球莖HMGR氨基酸序列比對

選取包括霍山石斛在內(nèi)的7種植物的HMGR氨基酸序列，利用DNANAN軟件對其進(jìn)行序列多重比對分析。用不同顏色深淺背景來表示其相似性的高低，顏色越深相似性越高，相似性最高的地方可能存在著重要功能結(jié)構(gòu)域。分析結(jié)果表明，不同植物的HMGR之間具有較高的相似性，其相似性達(dá)到75.67%（圖1）。并且，在所選擇的7種植物中，霍山石斛與同屬于蘭科的鐵皮石斛和萬代蘭的相似性較其它植物高。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，霍山石斛HMGR的功能域氨基酸組成與其它植物幾乎一致，即兩個(gè)HMG-CoA結(jié)合基序-EMPVGYV/IQL/IP和TTEGCLVA（圖中用方框表示），兩個(gè)NADPH結(jié)合基序-DAMGMNM和GTVGGGT（圖中用下劃線表示）。

2.4 霍山石斛原球莖HMGR基因生物信息學(xué)分析

2.4.1 蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)分析 利用ProtParam對霍山石斛HMGR蛋白質(zhì)進(jìn)行理化性質(zhì)分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白由562個(gè)氨基酸組成，分子量為60.0 ku，理論等電點(diǎn)為8.41，由20種氨基酸組成，其中Ala、Leu和Ser所占比重較大，比例分別達(dá)到10.5%、10.3%和9.4%，Trp含量最低。負(fù)電荷氨基酸殘基總數(shù)為（Asp+Glu）為51，正電荷的總數(shù)（Arg+Lys）為56，分子式：C2 651H4 269N727O792S33，原子總數(shù)：8 472。預(yù)測結(jié)果還顯示該蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為40.42，高于域值40，是一個(gè)不穩(wěn)定蛋白；脂肪系數(shù)為93.58；總平均疏水指數(shù)（GRAVY）為0.125，表明它是一個(gè)疏水蛋白。

利用ProtScale對蛋白的親水性和疏水性進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明：在第88個(gè)氨基酸表現(xiàn)為疏水性最強(qiáng)，為2.733；在第549個(gè)氨基酸表現(xiàn)為親水性最強(qiáng)，為-2.256，并且疏水氨基酸的數(shù)量大于親水氨基酸的數(shù)量，所以推斷HMGR蛋白為疏水性蛋白，其結(jié)果與ProtParam軟件中預(yù)測的相似。

2.4.2 跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測分析 利用TMHMM工具對霍山石斛HMGR蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測（圖2），結(jié)果表明：HMGR可能會(huì)在81～103位氨基酸處形成一個(gè)跨膜螺旋，HMGR蛋白的跨膜螺旋氨基酸期望值為41.387 87遠(yuǎn)大于18，因此該蛋白很可能是一個(gè)跨膜蛋白。從N末端開始的前60個(gè)氨基酸期望值（Exp number，first 60 Aas）為9.425 54，小于10，因此可以預(yù)測霍山石斛HMGR蛋白不具有信號肽的序列，其中81～103處的跨膜螺旋可形成N末端在膜內(nèi)的跨膜螺旋的概率達(dá)到了0.570 38，由此也可以推斷霍山石斛HMGR蛋白可能是一個(gè)跨膜蛋白。

2.4.3 信號肽預(yù)測分析 運(yùn)用SignalP 4.1 Server對霍山石斛HMGR蛋白的信號肽進(jìn)行預(yù)測。結(jié)果如下：霍山石斛HMGR剪切位點(diǎn)值（C值）最大為0.114，Y值（綜合考慮S值和C值的一個(gè)參數(shù)）最大為0.120，從N端氨基酸開始到剪切位點(diǎn)（1～10位）各氨基酸的平均值（Smean）為0.132，此段的D值（S平均值和Y最大值的加權(quán)平均值）達(dá)到了0.125，小于0.5。由此看出，霍山石斛HMGR蛋白不含有信號肽，推斷其不是分泌蛋白，該蛋白可能是在細(xì)胞質(zhì)中合成后保留在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中，而不參與細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸作用。對其它植物的HMGR氨基酸序列的信號肽進(jìn)行分析也得到了一樣的結(jié)果，即HMGR不具有信號肽。

2.4.4 亞細(xì)胞定位預(yù)測分析 蛋白質(zhì)只有處于特定的亞細(xì)胞位置才能發(fā)揮其功能，故亞細(xì)胞定位對蛋白質(zhì)的功能研究存在著十分重要的意義[17]。運(yùn)用PSORT軟件對霍山石斛HMGR蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明：霍山石斛HMGR定位于線粒體內(nèi)膜的可能性最大，為68.8%。其次是細(xì)胞膜，可能性為60.0%。定位于高爾基體和葉綠體類囊體膜的可能性較低，分別為40.0%和30.9%。由此可以推測該蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)中參與代謝活動(dòng)。

2.4.5 磷酸化位點(diǎn)和功能位點(diǎn)的預(yù)測分析 蛋白質(zhì)磷酸化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾的重要內(nèi)容之一，其對蛋白質(zhì)活力和功能有著重要的調(diào)節(jié)和控制作用[18]。利用NetPhos 2.0 Server預(yù)測霍山石斛HMGR蛋白的磷酸化位點(diǎn)，結(jié)果表明在多肽鏈中可能發(fā)生磷酸化的有絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr），其中以絲氨酸磷酸化位點(diǎn)最多，有18個(gè)，預(yù)測的最高分達(dá)到0.995，在第109位氨基酸處；其次是蘇氨酸，達(dá)到7個(gè)磷酸化位點(diǎn)，分別為第16、44、184、237、277、395、412位氨基酸處；酪氨酸的磷酸化位點(diǎn)只有2個(gè)，分別在第198和212位氨基酸處。

通過PredictProtein在線軟件對霍山石斛HMGR蛋白功能位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測與分析。結(jié)果表明，該蛋白含2個(gè)N-糖基化位點(diǎn)（ASN_Glycosylation）、11個(gè)蛋白激酶C 磷酸化位點(diǎn)（PKC_Phospho_site）、5個(gè)蛋白激酶II 磷酸化位點(diǎn)（CK2_ Phospho_site）、10 個(gè)N-?；稽c(diǎn)（Myristyl）、1個(gè)羥甲基戊二酸輔酶A還原酶信號1位點(diǎn)、1個(gè)羥甲基戊二酸輔酶A還原酶信號2位點(diǎn)和1個(gè)羥甲基戊二酸輔酶A還原酶信號3位點(diǎn)。

2.4.6 保守結(jié)構(gòu)域的預(yù)測分析 蛋白結(jié)構(gòu)與其發(fā)揮的功能密切相關(guān)，結(jié)構(gòu)的保守性與功能的保守性呈正相關(guān)。通過NCBI-CDS在線軟件分析霍山石斛HMGR蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白含有典型的HMG-CoA_reductase_class1保守結(jié)構(gòu)域（第146～549位），該基因序列主要負(fù)責(zé)催化萜類化合物生物合成途徑中的輔酶A和甲羥戊酸的生成。這些結(jié)果進(jìn)一步說明了本實(shí)驗(yàn)克隆所得的霍山石斛HMGR基因?qū)儆贖MGR基因家族（圖3）。

2.4.7 卷曲螺旋的預(yù)測分析 利用COILS對霍山石斛HMGR蛋白進(jìn)行蛋白卷曲螺旋預(yù)測，結(jié)果顯示：霍山石斛HMGR蛋白在window=14、21和28時(shí)，形成卷曲螺旋的預(yù)測概率都較低，均遠(yuǎn)低于0.5，說明霍山石斛HMGR蛋白不能形成卷曲螺旋結(jié)構(gòu)。

2.4.8 二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測分析 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)對于深入研究蛋白質(zhì)的生物活性具有重要作用。利用PredictProtein對霍山石斛HMGR蛋白的二級結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果為：HMGR的結(jié)構(gòu)由α螺旋、β折疊和無規(guī)則卷曲組成。在整個(gè)蛋白中，α螺旋和無規(guī)則卷曲所占比例較大，分別為45.91%和41.64%，而β折疊只占12.46%。

以人類（Homo sapiens）的HMGR（2q6bA）作為模型，利用SWISSMODEL對霍山石斛HMGR蛋白進(jìn)行同源建模，得到其三維結(jié)構(gòu)如圖4所示?？梢钥闯鲈摰鞍椎闹饕Y(jié)構(gòu)元件是α螺旋、β折疊和無規(guī)則卷曲。

2.4.9 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建 將從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載具有代表性的物種的HMGR蛋白與霍山石斛HMGR的編碼蛋白，采用MEGA5.0軟件分析構(gòu)建HMGR的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖5）。從進(jìn)化樹結(jié)果可以看出，HMGR根據(jù)種屬關(guān)系被準(zhǔn)確的分為植物、動(dòng)物和真菌3大類，霍山石斛HMGR與黃姜HMGR的親緣關(guān)系比較近，聚為同一類，因此可以推測霍山石斛HMGR與黃姜HMGR的功能間具有一定的相似性，在甲羥戊酸途徑中起到調(diào)控作用。

2.4.10 霍山石斛試管苗不同組織中HMGR基因定量表達(dá)分析 在溶解曲線、擴(kuò)增曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線滿足試驗(yàn)要求的前提下，以18 S rRNA為內(nèi)參基因，檢測霍山石斛試管苗不同組織中HMGR基因的表達(dá)水平，其相對表達(dá)量見圖6。HMGR基因在莖中的相對表達(dá)量最高，葉次之，且幼葉要高于老葉，根中最少。

3 討論與結(jié)論

3.1 霍山石斛HMGR蛋白的結(jié)構(gòu)功能預(yù)測

HMGR基因作為萜類生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因而倍受關(guān)注，目前已從巴西橡膠樹、馬鈴薯、紅豆杉等植物中分離克隆。將獲得的霍山石斛HMGR基因ORF推導(dǎo)的氨基酸序列登錄到NCBI網(wǎng)站，用BLAST進(jìn)行蛋白質(zhì)相似性檢索，發(fā)現(xiàn)該序列與金釵石斛（AFD23288.1）的相似性最高達(dá)到了97%，與其他植物比較也具有較高的相似性，基本都到達(dá)70%。序列和結(jié)構(gòu)較高的相似性說明HMGR基因在植物中具有很高的保守性，說明本次克隆得到的HMGR基因序列準(zhǔn)確可靠，屬于HMGR基因家族的一員。

從生物信息學(xué)的角度對核酸和氨基酸序列進(jìn)行分析，并對其結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行預(yù)測，可為生命現(xiàn)象的本質(zhì)提供一定的理論參考依據(jù)[19]。對霍山石斛HMGR蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白屬于疏水性的跨膜蛋白，不含信號肽結(jié)構(gòu)，推斷其是一種在細(xì)胞質(zhì)中直接行使其作用的蛋白。對其它植物HMGR的生物信息學(xué)進(jìn)行分析得到一樣的結(jié)論。在重要功能域方面，霍山石斛HMGR擁有與其他植物幾乎相似的氨基酸組成，即2個(gè)HMG-CoA結(jié)合基序（EMPVGYVQLP和TTEGCLVA）和2個(gè)NADPH結(jié)合基序（DAMGMNM和GTVGGGT）。有研究表明，TTEGCLVA中的谷氨酸Glu在HMGR起催化作用過程中占據(jù)重要位置[20]。本研究獲得的霍山石斛HMGR基因的序列信息以及結(jié)構(gòu)分析，可為后期通過分子生物學(xué)手段調(diào)節(jié)HMGR的基因表達(dá)，進(jìn)而研究HMGR基因的表達(dá)水平與倍半萜類石斛堿含量的相關(guān)性，從而提高倍半萜類石斛堿的含量奠定基礎(chǔ)。

3.2 HMGR基因與霍山石斛倍半萜類生物堿合成的相關(guān)性

MVA途徑長期以來被認(rèn)為是萜類化合物合成的重要途徑，而HMGR基因則被認(rèn)為是該途徑中的一個(gè)重要調(diào)控點(diǎn)，其表達(dá)水平與許多萜類化合物生物合成密切相關(guān)。在研究青蒿素生物合成代謝中發(fā)現(xiàn)，HMGR作為該途徑的限速酶，其酶活性的調(diào)節(jié)影響細(xì)胞中甲羥戊酸的儲(chǔ)蓄和青蒿素的積累[21-23]。在丹參的毛狀根中超表達(dá)HMGR基因，發(fā)現(xiàn)不僅植物酶活性提高，丹參酮和角鯊烯的產(chǎn)量也有所增加[24]。杜娟[25]在對蹄葉橐吳萜類化合物-紫菀酮的研究中發(fā)現(xiàn)相比于野生型對照植物，超表達(dá)HMGR基因的轉(zhuǎn)基因植株中紫菀酮的含量較多。將N端缺失的HMGR基因在轉(zhuǎn)基因薰衣草中過表達(dá)，結(jié)果促進(jìn)了薰衣草精油及植物甾醇的產(chǎn)生[26]。

為了解HMGR基因與霍山石斛倍半萜類生物堿合成的相關(guān)性，本研究對霍山石斛不同組織中HMGR基因進(jìn)行了定量表達(dá)分析，結(jié)合丁亞平[27]等對霍山石斛不同組織中生物堿含量的研究發(fā)現(xiàn)，HMGR基因在葉和莖中的表達(dá)水平要明顯高于根中，而生物堿含量為葉>莖≈根。導(dǎo)致該現(xiàn)象的可能原因有：霍山石斛生物堿的生物合成是經(jīng)過多步生化反應(yīng)后才完成的，HMGR的催化作用處于較上游，其后還有多種酶的相互協(xié)同作用影響著生物堿的合成；霍山石斛生物堿的合成除了通過MVA途徑外，還可能通過MEP途徑和莽草酸途徑。

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