角果木Mn—SOD基因分離及其在酵母中的功能鑒定

王鶴鳴等

摘 要 為明確抗氧化系統(tǒng)在植物抵御鹽脅迫中的作用，采用RT-PCR的方法分離角果木抗氧化酶相關(guān)基因Mn-SOD，采用酶切連接法構(gòu)建酵母表達(dá)載體pYES2/MnSOD，獲得含有重組質(zhì)粒的酵母菌INVScⅠ（pYES2/MnSOD）能有效表達(dá)MnSOD特異蛋白帶。高濃度鹽脅迫篩選結(jié)果表明，Mn-SOD基因在酵母中的表達(dá)能明顯提高酵母菌INVSCⅠ的耐鹽性。

關(guān)鍵詞 角果木；耐鹽性；Mn-SOD基因；酵母菌

中圖分類號(hào) Q943 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract To study the function of antioxidant system against salt stress， the MnSOD gene from Ceriops tagal was cloned by RT-PCR. The Mn-SOD gene was inserted into pYES2 and transformed into yeast cells. The MnSOD protein was successfully expressed in yeast by SDS-PAGE analysis. High concentration of salt stress tests indicated that expression of Mn-SOD gene in yeast could significantly improve the salt tolerance of yeast strain INVScⅠ.

Key words Ceriops tagal； Salt tolerance； Mn-SOD； Yeast

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.10.014

正常生長(zhǎng)條件下，植物體內(nèi)活性氧產(chǎn)量較低，并且處于一種相對(duì)平衡狀態(tài)，當(dāng)環(huán)境條件發(fā)生改變時(shí)，這種動(dòng)態(tài)平衡被打破，活性氧大量生成[1]?；钚匝醯拇罅勘l(fā)會(huì)導(dǎo)致核酸的損傷、蛋白質(zhì)氧化、脂質(zhì)過氧化，從而引起許多細(xì)胞喪失功能[2]。在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中，植物細(xì)胞往往會(huì)進(jìn)化出先進(jìn)的防御系統(tǒng)對(duì)抗活性氧，包括酶促和非酶促系統(tǒng)[3]。超氧化物歧化酶（SODs）是細(xì)胞對(duì)活性氧防御體系的第一道防線；這些酶迅速將超氧陰離子（O2·- ）和水（H2O）轉(zhuǎn)換為過氧化氫（H2O2）和分子氧（O2）[4-5]。

大多數(shù)植物含有一系列的超氧化物歧化酶同功酶。根據(jù)金屬輔因子的不同，超氧化物歧化酶分為3種類型：鐵離子超氧化物歧化酶（Fe-SOD），錳離子超氧化物歧化酶（Mn-SOD），以及銅-鋅超氧化物歧化酶（Cu/ ZnSOD），分別位于細(xì)胞不同組分中。有研究結(jié)果表明，細(xì)胞受到有害輻射、氧化還原試劑、病毒感染、逆境脅迫等傷害時(shí)，Mn-SOD含量及酶活性會(huì)明顯增高，起到保護(hù)DNA、降低細(xì)胞癌變機(jī)率的作用；過量表達(dá)Mn-SOD可以使植株在受到氧化脅迫時(shí)提高其抗逆性[6]。

角果木屬于紅樹科角果木屬典型的非泌鹽性紅樹植物，具有很強(qiáng)的耐鹽性[7]。在長(zhǎng)期的進(jìn)化中形成了自己獨(dú)特的耐鹽機(jī)制，當(dāng)受到鹽脅迫時(shí)，其體內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）等抗氧化酶類活性大大增加，且這些酶類的活性與受到鹽脅迫的程度呈正相關(guān)性[7]。目前已經(jīng)有相關(guān)研究結(jié)果表明，將檉柳Mn-SOD轉(zhuǎn)入酵母INVSc I中可以提高酵母的抗鹽、抗干旱、抗高溫能力[8-9]。本課題組前期采用數(shù)字表達(dá)譜技術(shù)對(duì)鹽脅迫下角果木根系差異表達(dá)基因進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)Mn-SOD受到鹽脅迫時(shí)表達(dá)量顯著增加（待發(fā)表數(shù)據(jù)）。為進(jìn)一步研究該基因的耐鹽功能，本研究分離了Mn-SOD的全長(zhǎng)cDNA序列，并轉(zhuǎn)入酵母中過表達(dá)后進(jìn)行酵母耐鹽性功能驗(yàn)證，酵母作為最常用的的真核表達(dá)載體，相對(duì)于原核表達(dá)載體大腸桿菌，具有對(duì)表達(dá)的目的蛋白進(jìn)行翻譯后修飾的功能，比如信號(hào)肽的剪切、糖基化等，對(duì)于基因的功能研究更有意義。本研究在酵母中探索了Mn-SOD的耐鹽性，為進(jìn)一步闡明抗氧化系統(tǒng)在鹽生植物耐鹽中所發(fā)揮的作用及機(jī)理奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

角果木成熟胎生苗采自海南省東寨港紅樹林保護(hù)區(qū)。選擇無病蟲害，發(fā)育良好，形態(tài)大小且成熟度相似的胎生苗，在Hoagland營(yíng)養(yǎng)液[10]中培育至幼苗長(zhǎng)出第二對(duì)葉，在500 mmol/L NaCl溶液中分別處理1、3、6、9、12、24 h，取根，加液氮充分研磨成粉末，-80 ℃保存，用于RNA提取。

1.2 方法

1.2.3 酵母表達(dá)載體構(gòu)建 根據(jù)引物末端添加的酶切位點(diǎn)，Xba I和Kpn I雙酶切TA克隆，回收Mn-SOD基因片段；同樣的酶組合酶切酵母表達(dá)載體pYES2，回收載體大片段，按外源片段分子末端：載體片段分子末端=3 ： 1的比例進(jìn)行連接；連接產(chǎn)物熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，重組菌落經(jīng)PCR和酶切檢測(cè)，陽性克隆命名為pYES2/MnSOD。

重組質(zhì)粒pYES2/MnSOD采用PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入缺陷型酵母表達(dá)菌株INVSc I，在尿嘧啶缺失的固體合成培養(yǎng)基（SC-Ura）上，30 ℃倒置培養(yǎng)至長(zhǎng)出單克隆菌落，進(jìn)行菌落PCR，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.4 目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)檢測(cè) 取鑒定后的重組酵母菌單克隆于SC-Ura液體培養(yǎng)基中，200 r/min，30 ℃過夜培養(yǎng)至菌液濃度為OD600=0.5，按照1 ∶ 500比例稀釋于SC-Ura液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中（用2%半乳糖替代碳源葡萄糖），誘導(dǎo)培養(yǎng)20 h，取1.5 mL濃度為OD600=2.5的菌液于離心管中，8 000 r/min 離心5 min，收集菌體，100 μL ddH2O重懸菌體，再加入100 μL 0.2 mol/L NaOH溶液裂解細(xì)胞5 min，收集上清即為蛋白抽提液。經(jīng)SDS-PAGE膠分離后考馬斯亮藍(lán)染色，拍照分析。

1.2.5 重組酵母菌的鹽脅迫處理 酵母菌INVSc I（pYES2）和酵母菌INVSc I（pYES2/MnSOD）分別用SC-Ura液體培養(yǎng)基+1 mol/L NaCl溶液和SC-Ura液體培養(yǎng)基+3 mol/L NaCl溶液30 ℃培養(yǎng)72 h，以SC-Ura液體培養(yǎng)基+ddH2O作為對(duì)照。取等體積菌液稀釋105倍后接種在SC-U固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)，對(duì)平板上酵母菌INVSc I（pYES2）和INVSc I（pYES2/MnSOD）的鹽脅迫后生長(zhǎng)情況進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 根部總RNA提取結(jié)果

角果木根部總RNA 甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果見圖1所示。提取0～24 h內(nèi)7個(gè)時(shí)間點(diǎn)的RNA，其均有明顯的18 S和28 S RNA條帶，且?guī)瓮暾?，無明顯的擴(kuò)散現(xiàn)象，表明所分離的RNA無污染，質(zhì)量符合后續(xù)研究要求。

2.2 Mn-SOD基因的分離及分析

以反轉(zhuǎn)錄獲得的第一鏈cDNA為模板，含有Xba I和Kpn I酶切位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果表明，擴(kuò)增條帶位于750 bp左右，與預(yù)期大小一致（圖2）。

陽性重組克隆測(cè)序（圖3）結(jié)果表明，所擴(kuò)增條帶大小為799 bp，其中CDs序列全長(zhǎng)717 bp，與角果木轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果100%一致。GeneScan軟件分析表明，該基因編碼238個(gè)氨基酸殘基，其中35～115位氨基酸為Fe/Mn-SOD家族的α發(fā)卡結(jié)構(gòu)域，125～230位氨基酸殘基為Fe/Mn-SOD家族的C端保守結(jié)構(gòu)域，該蛋白等電點(diǎn)為 6.79，蛋白質(zhì)分子量為26.4 ku。

利用推測(cè)的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析顯示，所搜索到的100條序列均為Mn-SOD基因的氨基酸序列，同源性位于68%～77%之間，其中同源性最高（77%）的為橡膠Mn-SOD基因（登錄號(hào)：P35017）編碼的氨基酸序列。應(yīng)用ClustalW2軟件對(duì)同源性較高的前10個(gè)序列進(jìn)行多重比較和進(jìn)化分析，結(jié)果表明，本研究分離的Mn-SOD單獨(dú)成一個(gè)分枝，與同源性最高的橡膠Mn-SOD距離較遠(yuǎn)，卻與同源性較低的PRUPE較近（圖4）。

2.3 酵母表達(dá)載體構(gòu)建

Mn-SOD基因片段和酵母菌載體pYES2雙酶切后相連得到重組質(zhì)粒，該重組子經(jīng)過PCR鑒定后進(jìn)行雙酶切鑒定，1%的瓊脂糖凝膠結(jié)果表明，酶切獲得729 bp的條帶，與預(yù)期大小一致（圖5）。證明Mn-SOD基因已經(jīng)成功連入pYES2載體，該重組質(zhì)粒命名為pYES2/MnSOD（圖6）。

2.4 重組質(zhì)粒酵母轉(zhuǎn)化的鑒定

PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母菌INVScⅠ中，在SC-Ura培養(yǎng)基上直至長(zhǎng)出單克隆菌落。菌落PCR檢測(cè)，產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖7。從圖7可以看出，pYES2/MnSOD轉(zhuǎn)化后長(zhǎng)出的酵母均能擴(kuò)增出預(yù)期大小的條帶，編號(hào)為4的酵母擴(kuò)增條帶最亮，因而挑選4號(hào)酵母作為下一步研究的試驗(yàn)材料。

2.5 目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)檢測(cè)

為檢測(cè)Mn-SOD基因在酵母菌INVScⅠ中的表達(dá)情況，本研究提取了轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒和空載體的酵母菌INVSc I蛋白抽提液，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，含有重組質(zhì)粒的酵母菌落蛋白提取液中有一條明顯的蛋白帶，而攜帶空載體的酵母菌INVScⅠ中缺乏該條帶，該條帶位于25～35 ku之間，表明Mn-SOD在酵母細(xì)胞中能有效表達(dá)特征條帶（圖8）。

2.6 重組酵母菌的耐鹽性分析

菌落計(jì)數(shù)結(jié)果表明，這兩種酵母都能夠生長(zhǎng)，但重組酵母菌的生長(zhǎng)情況明顯好于轉(zhuǎn)入空載體的酵母菌，鹽脅迫濃度越高，兩者差異越明顯（圖9）。

進(jìn)一步對(duì)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的酵母菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)分析，結(jié)果表明，鹽脅迫抑制了酵母菌的生長(zhǎng)，隨著鹽濃度的增加，抑制作用逐漸增強(qiáng)，未處理時(shí)，空載體和轉(zhuǎn)入Mn-SOD基因的酵母菌落數(shù)差異不顯著，處理6 h和24 h后，INVScⅠ（pYES2/MnSOD）菌落數(shù)量均極顯著高于轉(zhuǎn)入空載體的酵母菌INVScⅠ（pYES2）（p<0.1）（圖10），這表明在相同鹽脅迫條件下，外源Mn-SOD基因的表達(dá)提高了酵母菌INVScⅠ（pYES2/MnSOD）的耐鹽性。

3 討論與結(jié)論

植物對(duì)鹽脅迫的耐受反應(yīng)是近年來植物領(lǐng)域研究的一個(gè)重點(diǎn)，隨著各種研究手段的不斷發(fā)展，積累了越來越多的鹽脅迫應(yīng)答資料，目前公認(rèn)的植物應(yīng)答鹽脅迫的生理機(jī)制包括形態(tài)適應(yīng)性、離子平衡、滲透調(diào)節(jié)和活性氧的清除，其中活性氧清除機(jī)制更是普遍存在于鹽生植物和非鹽生植物中。植物在高鹽環(huán)境下體內(nèi)活性氧爆發(fā)造成動(dòng)態(tài)失衡，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞的生物膜系統(tǒng)造成傷害[12-13]。為減輕這種傷害，植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中，形成了活性氧清除機(jī)制，包括非酶類抗氧化保護(hù)系統(tǒng)和酶類抗氧化保護(hù)系統(tǒng)兩大類。而酶類抗氧化保護(hù)系統(tǒng)又包括超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽還原酶（GR）等[14]，其中超氧化物歧化酶（SOD）是第一個(gè)參與的酶類，能將超氧陰離子歧化為H2O2和O2，在酶類抗氧化保護(hù)系統(tǒng)占主要位置[15]。目前SOD基因的功能驗(yàn)證研究主要還是導(dǎo)入植物進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，馬淑娟等將Cu/Zn-SOD轉(zhuǎn)入煙草使其耐衰老能力和抗氧化能力都增強(qiáng)[16]。覃鵬等[17]研究發(fā)現(xiàn)，外源Mn-SOD基因的導(dǎo)入能提高煙草抗旱能力，而Fe-SOD基因的導(dǎo)入雖能提高煙草體內(nèi)的SOD活性水平，但不能提高煙草的抗旱性?？梢?，SOD基因的研究具有廣闊的研究前景和研究?jī)r(jià)值。本文對(duì)紅樹角果木在高鹽逆境脅迫下的Mn-SOD進(jìn)行功能解析，表明SOD基因與植物的多種逆境相關(guān)，不僅從一個(gè)側(cè)面闡述了角果木抗逆性極強(qiáng)的緣由，更清晰地表明，來自角果木的Mn-SOD與植物的耐鹽度成正相關(guān)。

生長(zhǎng)在海岸潮間帶的紅樹植物-角果木，作為一種典型的非泌鹽性真紅樹植物，在長(zhǎng)期的自然選擇下形成了一套有效的活性氧清除機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)比了鹽脅迫下角果木離子平衡、抗氧化脅迫等相關(guān)生理指標(biāo)的差異[7]，結(jié)果表明，脅迫早期抗氧化相關(guān)的SOD、POD等酶活性顯著上升，MDA的變化不明顯；并采用轉(zhuǎn)錄組和數(shù)字表達(dá)譜技術(shù)進(jìn)行差異基因的篩選，候選SOD等基因。為進(jìn)一步明確抗氧化保護(hù)系統(tǒng)在紅樹植物耐鹽中發(fā)揮的作用，本研究采用RT-PCR方法分離了Mn-SOD基因，并在酵母中進(jìn)行功能驗(yàn)證，結(jié)果表明，Mn-SOD基因的過表達(dá)能顯著提高酵母的耐鹽性，這與Takemura等的研究結(jié)果一致[18]，意味著通過調(diào)控抗氧化酶的表達(dá)有可能獲得耐鹽性提高的轉(zhuǎn)基因植物，這為開展熱帶作物抗逆育種提供了試驗(yàn)依據(jù)。但在紅樹植物中耐鹽性的產(chǎn)生是抗氧化系統(tǒng)發(fā)揮主要作用還是其他生理機(jī)制發(fā)揮主要作用還有待進(jìn)一步研究。

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