木薯試管微型薯與田間塊根的結(jié)構(gòu)發(fā)育比較

唐緒飛等

摘 要 以華南8號木薯（Manihot esculenta Crantz cv. South China 8）無菌苗嫩莖為材料，采用植物組織培養(yǎng)方法獲得試管微型薯，利用組織解剖學(xué)及組織化學(xué)方法研究木薯試管微塊根（微型薯）的形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)育以及田間木薯塊根形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)育，結(jié)果表明：木薯在組培條件下形成的微型薯沒有次生結(jié)構(gòu)的分化，微型薯的膨大在結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)為初生根皮層細胞體積的增大以及細胞間隙的增加。而田間塊根的膨大在結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)為次生結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生以及大量淀粉的積累；組培微型薯和田間塊根淀粉積累相比，存在時間上和空間上的差異，早期生長的微型薯沒有淀粉的積累，生長5～10 d后在皮層薄壁細胞可見淀粉粒分布。而田間生長的木薯塊根的淀粉是在初生根產(chǎn)生次生結(jié)構(gòu)后就開始積累，淀粉主要積累在次生木質(zhì)部，少部分分布于皮層薄壁細胞和韌皮部。

關(guān)鍵詞 木薯；組培；微型薯；塊根；解剖結(jié)構(gòu)

中圖分類號 S533 文獻標識碼 A

Abstract Manihot esculenta Crantz cv. South China 8 was used as the experimental material. The method of tissue culture was applied to obtain the micro-tuber. The development and morphological structure of cassava in micro-tuber and tuber was studied by the method of anatomical technology. The conclusions of the analysis are as follows： 1） In vitro， there was no secondary tissue formed in the whole procession of micro-tuber induction. The expansion of micro-tuber was the results of the enlargement of cortical parenchyma cell volume and intercellular space. Not like micro-tuber， the tuber in field-grown formed secondary tissue and a large number of starch grains stored in xylem parenchyma cells. 2） There was a time and space difference in starch accumulation between micro-tuber root and tuber. There was no starch grains in micro-tuber until five to ten days cultured. A small amount of starch grains occurred in the cortical parenchyma cells. The starch in field-grown cassava roots was produced in the primary root after secondary structure beginning to accumulate. Starch mainly accumulated in the secondary xylem parenchyma cells. A small number of distribution in the cortex and phloem.

Key words Cassava；Tissue culture；Micro-tuber；Tuber；Anatomical structure

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.10.002

木薯（Manihot esculenta Crantz），別名樹薯、樹番薯，系大戟科（Euphorbiaceae）木薯屬（Manihot）灌木，是一種重要的亞熱帶、熱帶經(jīng)濟作物，因其塊根淀粉含量較高，被列為三大薯類之一[1]。

目前木薯的生物學(xué)研究主要集中在遺傳育種、組織培養(yǎng)、生理學(xué)特性、采后生理生化等方面[2]。對于木薯塊根的形成和淀粉積累機制的研究尤其受到關(guān)注。由于木薯塊根的發(fā)育和成熟需要6～8個月，且塊根深藏于土壤中，觀察和挖取費時費力[3]。有研究者提出用組培誘導(dǎo)出的微型薯替代塊根材料做相應(yīng)的研究[4]。然而，組培條件下形成的微型薯與田間栽培的木薯塊根在組織結(jié)構(gòu)上、貯藏積累淀粉能力和機制上是否一致，能否用微型薯替代塊根做相關(guān)的生物學(xué)研究有待進一步研究。

本研究通過組織培養(yǎng)的方法誘導(dǎo)木薯微型薯的形成，運用解剖學(xué)和組織化學(xué)的方法來研究微型薯的發(fā)生發(fā)育，并與田間栽培的木薯塊根進行比較，探討二者間的結(jié)構(gòu)差異以及發(fā)生發(fā)育過程中的淀粉積累動態(tài)變化，以期豐富不定根發(fā)生的生物學(xué)理論，并為深入開展木薯塊根及淀粉積累機制的研究提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以華南8號木薯（Manihot esculenta crantz cv.South China 8）為材料。由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶品種資源研究所木薯中心提供。

1.2 方法

1.2.1 材料種植與取樣 選擇成熟度一致，直徑大小近似或相等的華南8號木薯種莖種植于海南大學(xué)農(nóng)學(xué)基地，起壟種植，壟高20～30 cm，種前施足底肥，將種莖平放于種植穴中，覆土，間距1 m×1 m。種植后每隔10 d對不定根進行取樣，每次取3個種莖段，每個莖段上隨機選5條不定根，切成0.5～1 cm的切斷用FAA固定備用。

1.2.2 微型薯誘導(dǎo) 取自然條件下種植的華南8號木薯帶頂芽的嫩莖段作為外植體，去除葉片和部分葉柄，切成4～6 cm長的莖段放入錐形瓶中消毒滅菌。將滅好菌的材料接種于下面的培養(yǎng)基中。生根培養(yǎng)基：MS+0.5 mg/L NAA+3%蔗糖+0.3%植物凝膠；微型薯誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA+5%蔗糖+0.3%植物凝膠，pH 5.7～5.9；培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度為（25士2）℃，每天16 h光照和8 h黑暗，在光照強度為1 500～2 000 lx的培養(yǎng)室中培養(yǎng)。

1.2.3 切片和觀察 采用高碘酸-錫夫反應(yīng)法（PAS反應(yīng)法）制片，方法如下： 將取下的材料（初生根、微型薯、塊根）立即放入FAA固定液中固定。真空抽氣30～60 min后放入4 ℃冰箱備用；固定好的材料經(jīng)過系列梯度酒精脫水后用Van-clear透明劑透明；采用石蠟的熔點為54～56 ℃，在58 ℃烘箱中完成整個浸蠟過程；將浸好蠟的材料整齊的放入盛有蠟液的紙質(zhì)小船中，用加熱后的鐵勺子或鑷子趕走石蠟中尤其是材料周邊的氣泡；根據(jù)材料位置和所需的切面修整蠟塊，將浸有材料的蠟塊用單面刀片修整為梯狀體，用旋轉(zhuǎn)式切片機切出厚度為8～15 μm厚度的蠟帶；切片經(jīng)環(huán)保透明劑Van-clear透明和系列酒精復(fù)水后染色（染色步驟為：0.5% KIO4 10 min→自來水沖洗5 min →蒸餾水2 min →錫夫試劑25 min →漂洗液2 min →漂洗液2 min →自來水5 min →蒸餾水2 min）。后經(jīng)系列酒精脫水后透明，用環(huán)保塑料封片，將切片置于Leica DM2000數(shù)碼成像系統(tǒng)下顯微觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 微型薯的形態(tài)

微型薯可以通過2種途徑獲得，一種是直接誘導(dǎo)（直接將外植體接種于微型薯誘導(dǎo)培養(yǎng)基上）；另一種是二次誘導(dǎo)（先將外植體接種于生根培養(yǎng)基上，待其長出2～3 cm不定根時將整個植株轉(zhuǎn)接于微型薯培養(yǎng)基上培養(yǎng)）。經(jīng)過多次繼代的木薯健壯的無菌莖段在微型薯誘導(dǎo)培養(yǎng)基上可直接誘導(dǎo)為微型薯（圖1-1、1-2）10～15 d后在莖基部可觀察到木薯微型薯，直接誘導(dǎo)獲得的微型薯旁邊常伴有愈傷組織的形成，微型薯的發(fā)生位置從外部形態(tài)上看可分為2種情況：一種是從嫩莖基部發(fā)生；另一種從莖基部的愈傷組織發(fā)生。

取健壯的華南8號嫩莖段接種于生根培養(yǎng)基上，10 d后可觀察到初生的纖維根，待其長到一定長度后（約2 cm）將莖段連同根一起轉(zhuǎn)入微型薯誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2 d后就可以觀察到根的膨大，膨大的起始部位是根尖的生長區(qū)，后逐漸向根基處膨大，經(jīng)過5 d的誘導(dǎo)培養(yǎng)，部分木薯嫩莖基部可以觀察到木薯微型薯的雛形，培養(yǎng)10 d后，大部分木薯材料可觀察到微型薯，此時的微型薯形狀與自然條件下生長的塊根相似（圖1-3），長度約為2～3 cm，最長的可達5 cm，直徑為0.2～0.5 cm。微型薯薯塊的形狀有2種，一種呈“紡錘”形（圖1-4）；一種呈“梨”形（圖1-5）。隨著培養(yǎng)時間的增加，微型薯表面膨脹使多處地方出現(xiàn)裂痕，其組織松軟，容易脫落（圖1-6）。微型薯在培養(yǎng)基中主要分布在培養(yǎng)基表面，而纖維根則深向培養(yǎng)基內(nèi)部；所有的微型薯質(zhì)地松軟，呈現(xiàn)海綿狀，微型薯極其容易折斷，產(chǎn)生微型薯的材料很難再進行整體繼代培養(yǎng)。

2.2 微型薯的結(jié)構(gòu)

對微型薯的結(jié)構(gòu)進行解剖學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)：在微型薯整個發(fā)育過程中沒有次生結(jié)構(gòu)的分化，薯塊的膨大是皮層薄壁細胞的膨大和細胞間隙變大引起。微型薯誘導(dǎo)2 d時，皮層中間部分的細胞體積變大（圖2-1）；5 d后觀察到部分表皮破裂，皮層薄壁細胞體積繼續(xù)增加（圖2-2）；10 d后表皮層完全破裂，靠中柱的皮層薄壁細胞向外擴張，外部的皮層薄壁細胞散亂地排列在中柱周圍，細胞變形，細胞排列疏松，出現(xiàn)較大細胞間隙，中柱的維管組織和初生纖維根相比沒有太大的變化（圖2-3）。

最開始膨大的微型薯沒有淀粉的積累，生長到5 d左右，部分微型薯在皮層薄壁細胞上觀察到少量淀粉粒的存在（圖2-4），隨著誘導(dǎo)時間的增加，皮層淀粉粒數(shù)量增加（圖2-5）淀粉粒主要集中在皮層薄壁細胞邊緣，多數(shù)為單粒淀粉粒（圖2-6）。

2.3 田間木薯塊根的發(fā)生部位

栽培木薯發(fā)生不定根的位置在種莖切口處、托葉痕處、芽痕處和新長的木薯莖基部。種植3～5 d可觀察到不定根發(fā)生于芽痕處和葉痕處，切口處在種植7～15 d后可觀察到不定根的發(fā)生，從莖段外觀上依次表現(xiàn)為：愈傷形成、莖段表皮隆起出現(xiàn)根點、長出不定根。種莖形態(tài)學(xué)下端的切口比其形態(tài)學(xué)上端的切口有更多的不定根發(fā)生。種植50 d后，可發(fā)現(xiàn)部分不定根開始膨大形成塊根，膨大有一定的方向性，是由不定根的中間部或中下部向根基方向膨大。各個部位發(fā)生的不定根都有可能膨大為塊根。

2.4 田間木薯不定根發(fā)育的解剖結(jié)構(gòu)

木薯根的初生結(jié)構(gòu)為典型的雙子葉植物根的初生結(jié)構(gòu)。由表皮層、皮層和中柱3部分組成。表皮位于初生根的最外層，由1層細胞構(gòu)成，排列緊密，具有根毛。皮層分為外皮層，皮層薄壁細胞和內(nèi)皮層，占根的大部分。中柱包括中柱鞘、初生木質(zhì)部和初生韌皮部。中柱鞘為1～3層較小的薄壁細胞。初生木質(zhì)部束數(shù)變化較大，觀察到最少的為3束，最多的為8束。初生韌皮部分為原生韌皮部和后生韌皮部，二者很難區(qū)分。初生韌皮部聚集為圓塊狀，位于2束初生木質(zhì)部之間，初生木質(zhì)部和初生韌皮部各自成束且束數(shù)相同，交錯排列（圖3-1）。

初生根生長一定時期后發(fā)育為次生結(jié)構(gòu)，包括周皮和次生維管組織。周皮由木栓層、木栓形成層和栓內(nèi)層組成；次生維管組織由次生木質(zhì)部、次生韌皮部和維管形成層組成（圖3-2）。次生木質(zhì)部、韌皮部和皮層薄壁細胞有少量淀粉積累，次生木質(zhì)部的淀粉粒大多分布在次生木質(zhì)部的薄壁細胞內(nèi)（圖3-3）。

部分具有次生結(jié)構(gòu)的根，由于次生木質(zhì)部部分不斷生長，膨大形成塊根，淀粉主要積累在次生木質(zhì)部的薄壁細胞，特別是木射線薄壁細胞，在次生韌皮部細胞中也有淀粉粒分布。隨塊根不斷膨大，淀粉積累增多，淀粉粒主要積累在次生木質(zhì)部的薄壁細胞中，淀粉動態(tài)變化見圖3-4、3-5、3-6。

2.5 木薯試管微型薯和田間塊根的結(jié)構(gòu)差異

木薯可以通過離體培養(yǎng)形成試管微型薯，這種微型薯只是在形狀上類似于田間木薯塊根，二者在生長發(fā)育過程和結(jié)構(gòu)上有很大的差異，組培微型薯在整個生長過程中都沒有出現(xiàn)次生結(jié)構(gòu)的分化，有的甚至初生結(jié)構(gòu)都沒有分化完全，它的膨大主要是由于皮層薄壁細胞的膨大和細胞間隙的增加。而田間栽培的木薯根是初生根經(jīng)過次生生長產(chǎn)生次生結(jié)構(gòu)后才開始膨大的。

微型薯和田間塊根淀粉積累相比，存在時間上和空間上的差異，前期生長的組培微型薯沒有淀粉的積累，到后期才發(fā)現(xiàn)少量淀粉累積，這些淀粉主要積累在數(shù)量不多的皮層薄壁細胞，而田間生長的木薯塊根的大部分淀粉是在初生根產(chǎn)生次生結(jié)構(gòu)后就開始積累。這些淀粉粒主要積累在次生木質(zhì)部的薄壁細胞中，少部分分布于皮層薄壁細胞和韌皮部上。隨著次生木質(zhì)部不斷生長，淀粉粒的分布亦逐漸增多，最終含有大量淀粉粒的木薄壁細胞占據(jù)塊根的絕大部分。

3 討論與結(jié)論

目前，組培條件下微型薯的誘導(dǎo)的文獻多集中在馬鈴薯（Solanum tuberosum）上，對馬鈴薯微型薯的研究表明，馬鈴薯微型薯實質(zhì)是塊莖，其上有不定芽。由于體積小、重量輕，繁殖期間杜絕了外來病菌的再次侵染，貯藏、運輸、種植方便，可以替代試管苗作為繁殖材料[5]。而木薯的微型薯是塊根，且結(jié)構(gòu)疏松不緊實，上無不定芽，不宜作為繁殖材料。

木薯在組培條件下誘導(dǎo)形成塊根的報道目前還不多見。1974年Kartha等[6]在建立木薯無菌苗體系時偶然發(fā)現(xiàn)添加有萘乙酸（NAA）和6-芐氨基嘌呤（6-BA）的培養(yǎng)基可以誘導(dǎo)出形狀類似于木薯塊根的試管微型薯。這種微型薯只是在形態(tài)上和田間種植的木薯相似。有研究者指出塊根的形成是形態(tài)學(xué)、生理學(xué)和生物學(xué)次序作用的結(jié)果[7]。根結(jié)構(gòu)上的改變在很大程度上會導(dǎo)致其功能上改變，結(jié)構(gòu)不同的根功能會有所不同[8]。組培條件下誘導(dǎo)的微型薯沒有經(jīng)歷次生生長，其膨大的主要原因是皮層薄壁細胞體積的增加以及細胞間隙的增大。而田間栽培的木薯塊根是由不定根經(jīng)過次生增粗生長形成的，維管形成層不斷分裂出大量薄壁細胞，向外分化為次生韌皮部和周皮，向內(nèi)分化成次生木質(zhì)部，其中，次生木質(zhì)部占塊根的大部分比例。微型薯和田間塊根雖然在結(jié)構(gòu)上有差異，但是二者都具有貯藏淀粉的功能。不同的是，微型薯淀粉主要貯藏在皮層薄壁細胞中，而田間塊根的淀粉主要貯藏在次生木質(zhì)部的薄壁細胞中，除此之外，二者淀粉積累的時間也不相同，前期誘導(dǎo)出的微型薯并沒有淀粉的積累，隨誘導(dǎo)時間的增加，淀粉積累才開始積累并增加，最后導(dǎo)致微型薯表面出現(xiàn)裂痕。而田間塊根的淀粉在初生根產(chǎn)生次生結(jié)構(gòu)后就開始積累。

塊根是由不定根或側(cè)根經(jīng)過增粗生長形成的，這種增粗生長在不同植物根的結(jié)構(gòu)發(fā)育上表現(xiàn)是不一樣的。人參榕（Ficus microcarpa L.f）膨大塊根與未膨大塊根的主要差異在于膨大塊根中次生維管形成層和副形成層共同形成的次生維管組織、三生組織以及次生木質(zhì)部中淀粉大量積累[9]。懷地黃（Rehmannia glutinosa）塊根的增粗主要是維管形成層產(chǎn)生大量的次生木質(zhì)部薄壁組織細胞以及這些細胞增殖活動的結(jié)果[10]。對于某些植物，塊根的膨大并非是形成層活動導(dǎo)致，如麥冬（Ophiopogon japonicas ker-Gaul）的主要膨大部位是皮層，其塊根的膨大主要是皮層薄壁細胞的增加和淀粉的積累[11]。有學(xué)者研究了組培條件下太子參（Pseudostellaria hererophylla）的結(jié)構(gòu)與田間種植的太子參的結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，組培條件下形成的太子參微型塊根和田間種植的太子參形成塊根的機制是一致的，都是由于維管形成層向內(nèi)產(chǎn)生大量的次生木質(zhì)部薄壁細胞后淀粉的積累引起塊根的膨大[12]。但是筆者研究木薯組培條件下和田間條件下形成的塊根差異表明：將微型薯作為木薯塊根發(fā)育和淀粉積累機制的研究模型仍需進一步探討。

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