5個(gè)品種柳枝稷愈傷組織的生長(zhǎng)特點(diǎn)研究

劉斯佳等

摘要 [目的]通過(guò)對(duì)5個(gè)品種柳枝稷在現(xiàn)有的組培體系下不同的生長(zhǎng)特點(diǎn)研究，探討利用調(diào)整培養(yǎng)基配方等方法來(lái)實(shí)現(xiàn)不同品種的高效再生體系。[方法]采用柳枝稷5個(gè)品種Summer、Alamo、Kanlow、Blackwell和CaveinRock的種子為外植體，進(jìn)行愈傷組織組織培養(yǎng)，對(duì)5個(gè)品種在誘導(dǎo)、繼代、分化、生根以及移栽過(guò)程中愈傷組織的生長(zhǎng)情況進(jìn)行比較分析。[結(jié)果]在該體系下，出愈率的范圍是26.4%～71.2%，最高的是品種Summer，最低的是Alamo。只有Kanlow、Alamo、Summer可以分化出芽，長(zhǎng)出植株。分化率最高的是Kanlow，達(dá)到60%。[結(jié)論]所有品種均能很好生根和移栽；品種Kanlow在該體系下生長(zhǎng)最好。

關(guān)鍵詞 柳枝稷（Panicum virgatum）；愈傷組織；品種；再生體系

中圖分類(lèi)號(hào) S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）13-03819-04

Abstract [Objective] To discuss how to achieve efficient regeneration systems of different cultivars by comparing callus growth characteristics of five switchgrass cultivars under the same culture regeneration system. [Method] Seeds of five cultivars， Alamo， Blackwell， CaveinRock， Kanlow and Summer were used as the explants for callus culture. The analysis and comparisons of the growth characteristics in the process of callus induction， subculture， differentiation， rooting and transplanting were conducted. [Result] Callus induction rate ranged from 26.4% to 71.2%. The callus induction rate of Summer was the highest （71.2%）， while that of Alamo was the lowest（26.4%）. Only callus of Kanlow， Alamo， Summer could be differentiated and grow into plants. Kanlow possessed the highest differentiation rate peaking to 60%. [Conclusion] All the cultivars could root and transplant well. Kanlow grew best in the system.

Key words Switchgrass； Callus； Cultivar； Regeneration system

柳枝稷（Panicum virgatum）屬禾本科（Gramineae）黍?qū)伲≒anicum），原產(chǎn)于北美，是一種多年生暖季型的C4植物。柳枝稷適應(yīng)性強(qiáng)，具有較高的產(chǎn)量潛力，耐旱耐貧瘠能力較強(qiáng)，而且對(duì)環(huán)境友好，能夠用于生產(chǎn)能源，可以在不適宜其他作物生長(zhǎng)的邊際土地生長(zhǎng)并獲得較高的產(chǎn)量[1-2]。因此被國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者認(rèn)為是一種發(fā)展?jié)摿^大的能源作物[3-4]。

利用植物器官作為外植體建立高效再生體系，是組織培養(yǎng)最直接、最簡(jiǎn)便和成苗速度最快的途徑之一[5]。目前已有多種植物利用芽頂端分生組織[6-11]、莖節(jié)[12]和幼穗[13]作為外植體誘導(dǎo)叢生芽，建立了其植株再生體系。以柳枝稷種子為外植體進(jìn)行愈傷組織再生體系已有成功報(bào)道[14-16]，但已有研究基本是以柳枝稷品種Alamo為試驗(yàn)材料，其他品種的報(bào)道較為少見(jiàn)。不同品種的組培體系可能差異較大。柳枝稷品種間性狀差異較大，特別是不同生態(tài)型的品種間[17-18]，因此建立不同品種的組培體系，對(duì)于不同品種柳枝稷的分子改良工作具有重要意義。

筆者選擇柳枝稷高、低兩種生態(tài)型共5個(gè)品種為材料，在Ruyu Li和Rongda Qu[16]的組培體系下進(jìn)行研究，比較在該體系下，不同品種在組織培養(yǎng)誘導(dǎo)、繼代、分化等階段的表現(xiàn)；同時(shí)對(duì)每個(gè)階段表現(xiàn)不好的品種進(jìn)行分析，通過(guò)查閱文獻(xiàn)找出改善該品種表現(xiàn)的方法，以期為建立不同品種的高效組培體系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

研究對(duì)象。柳枝稷5個(gè)品種的種子（購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)，2010年收獲的種子）為外植體，其中低地型Alamo、Kanlow，高地型為Blackwell、CaveinRock、Summer。

1.2 方法

1.2.1

樣品的初處理。將采摘的樣品用5%的NaClO溶液處理2.5 h后，用去離子水沖洗3次，隔夜后，使用前再用5%的NaClO溶液處理1.5 h，并用無(wú)菌水沖洗3次后使用[19]。

1.2.2

愈傷組織的誘導(dǎo)[16]。采用MS培養(yǎng)基+5 mg/L 2，4D+1 mg/L 6BA+30 g/L麥芽糖+8 g/L瓊脂的配方，每盤(pán)培養(yǎng)皿放入25粒種子。5次重復(fù)。接種后以25 ℃、暗培養(yǎng)4周，觀察并記錄出愈的個(gè)數(shù)。把愈傷組織看成近似球形，通過(guò)量取直徑來(lái)測(cè)量愈傷組織大小，每個(gè)培養(yǎng)皿選取大中小3個(gè)愈傷組織進(jìn)行測(cè)量，并取其平均值。所得結(jié)果用Excel2007和The SAS System軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、分析和多重比較等。出愈率（%）=出愈種子數(shù)/種子總數(shù)×100。

1.2.3

愈傷組織繼代培養(yǎng)。配制成分為：MS培養(yǎng)基+5 mg/L 2，4D+1 mg/L 6BA+30 g/L麥芽糖+2 g/L脯氨酸+8 g/L瓊脂的繼代培養(yǎng)基，將長(zhǎng)出的愈傷組織去除芽體后，接種到繼代培養(yǎng)基中，繼續(xù)以25 ℃，黑暗處理的方式培養(yǎng)并觀察記錄數(shù)據(jù)。共繼代3次以保證愈傷組織的質(zhì)量及大小。在繼代過(guò)程中，為保證愈傷組織的大小一致，可對(duì)愈傷組織長(zhǎng)度超過(guò)5 mm的愈傷組織進(jìn)行適度剪切。

1.2.4

愈傷組織的分化。將繼代3次之后的愈傷組織，轉(zhuǎn)入成分為：MS培養(yǎng)基+0.5 mg/L GA+1 mg/L 6BA+0.2 mg/L NAA+30 g/L麥芽糖+8 g/L瓊脂分化培養(yǎng)基上，以25 ℃、16 h光照8 h黑暗處理，進(jìn)行分化。每盤(pán)放入15個(gè)愈傷組織，及時(shí)觀察并記錄數(shù)據(jù)。分化率（%）=分化的愈傷組織數(shù)/愈傷組織數(shù)×100。

1.2.5

愈傷組織的生根。待分化后的綠芽長(zhǎng)約1 cm時(shí)，即將帶有綠芽的愈傷組織轉(zhuǎn)入到1/2MS生根培養(yǎng)基中，進(jìn)行生根，長(zhǎng)成植株。生根率（%）=生根的愈傷組織數(shù)/分化的愈傷組織總數(shù)×100。

1.2.6

植株的移栽。待生根后的植株株高10 cm左右時(shí)，將植株從培養(yǎng)基中移出，用自來(lái)水將植株的根洗凈，移栽到裝有營(yíng)養(yǎng)土的花盆中，適時(shí)澆水，每周觀察，目測(cè)柳枝稷不同品種植株的高矮、葉片顏色、生活力。移栽率（%）=移栽后存活的愈傷組織數(shù)/生根的愈傷組織總數(shù)×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 5個(gè)品種愈傷組織的誘導(dǎo)階段的生長(zhǎng)特點(diǎn)

柳枝稷種子在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，3 d后長(zhǎng)出芽體和愈傷組織，6 d后部分種子盾片處長(zhǎng)出白色水浸狀、柔軟松散的愈傷組織，并且少量未發(fā)芽的種子也有愈傷

組織長(zhǎng)出。并且愈傷組織體積逐漸增大。到21 d后，愈傷組織大小基本穩(wěn)定。愈傷組織形態(tài)從松散白色變得緊實(shí)致密，大致呈長(zhǎng)方體。柳枝稷5個(gè)品種的出愈率范圍是出愈率的范圍是26.4%～71.2%，最高的是品種Summer最低的是Alamo（圖1）。

對(duì)長(zhǎng)出的愈傷組織進(jìn)行存活率的統(tǒng)計(jì)，其中品種Summer為99%，Alamo品種愈傷組織的存活率最低，為82%。通過(guò)對(duì)愈傷組織大小比較得出，愈傷組織直徑平均值最大的是Blackwell品種，為5.132 mm，Summer品種的愈傷組織的平均大小為4.600 mm，Alamo品種愈傷組織直徑最小，為3.374 mm（圖2）。

2.2 5個(gè)品種愈傷組織繼代培養(yǎng)階段的生長(zhǎng)特點(diǎn)

2.6 柳枝稷不同品種愈傷組織再生體系的影響因素

品種Alamo和Kanlow是低地型品種，分化率明顯高于后3種，因此，該體系更適合低地型品種，而不適用于高地型品種。

試驗(yàn)結(jié)果表明，柳枝稷5個(gè)品種的愈傷組織生長(zhǎng)表現(xiàn)出很大的差異。其中基因型差異可能是5個(gè)品種在該體系下表現(xiàn)出差異的重要原因，同時(shí)培養(yǎng)基的成分不同對(duì)愈傷組織的形成有很大的影響[20-21]。許文志等[14]以MS為基本培養(yǎng)的不同配方建立了Alamo的高效再生體系。另Jason N等[22]的研究采用LP9作為基本培養(yǎng)基，加入植物生長(zhǎng)激素建立了品種Alamo的高效再生體系。其他品種的高效再生體系還沒(méi)有見(jiàn)到相關(guān)報(bào)道，可以嘗試調(diào)整培養(yǎng)基成分來(lái)實(shí)現(xiàn)各品種的再生體系的建立。培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分Zn、Cu和Fe的含量是影響愈傷組織誘導(dǎo)及分化的重要因素，提高M(jìn)S培養(yǎng)基中的Fe、B、Zn和Mn的含量可以提高愈傷組織誘導(dǎo)率和分化率，并且提高愈傷組織的質(zhì)量[23]。

愈傷組織誘導(dǎo)后是先形成松軟的愈傷組織，再由松軟的愈傷組織形成緊湊的愈傷組織，只有緊湊、干燥的愈傷組織才能分化成苗[24]。因此，提高愈傷組織的質(zhì)量才能有效提高愈傷組織的分化率。低溫預(yù)處理小麥幼穗和花蕾外植體可提高花粉愈傷組織產(chǎn)量，預(yù)處理溫度越低且處理時(shí)間越長(zhǎng)， 植物對(duì)培養(yǎng)反應(yīng)的抑制作用越大[25]。因此可以嘗試對(duì)誘導(dǎo)率低的品種如Blackwell等，進(jìn)行低溫預(yù)處理來(lái)增加出愈率，提高愈傷組織的質(zhì)量，以及愈傷組織的分化率來(lái)完善柳枝稷不同品種愈傷組織培養(yǎng)體系的建立。

3 結(jié)論

柳枝稷5個(gè)品種的出愈率范圍是26.4%～71.2%。出愈率最高的品種是Summer，最低是品種Alamo。愈傷組織直徑平均值最大的是Blackwell，為5.132 mm，Alamo品種愈傷組織直徑最小，為3.374 mm。5個(gè)品種的愈傷組織在繼代培養(yǎng)基中可以繼續(xù)生長(zhǎng)，隨著繼代次數(shù)的增加，愈傷組織變得緊湊、干燥，質(zhì)量有所提高。5個(gè)品種的愈傷組織中只有3個(gè)品種可以分化出綠芽。Kanlow品種的愈傷組織分化率最高，為60%，Alamo和Summer品種分別達(dá)到16.67%和4.76%。分化的愈傷組織在生根培養(yǎng)基中都能100%生長(zhǎng)，并且移入花盆中都能很好生長(zhǎng)，目測(cè)大小、長(zhǎng)勢(shì)、生活力無(wú)明顯區(qū)別。在5個(gè)品種中，品種Kanlow分化率最高，出愈率、愈傷組織存活率、愈傷組織大小第4。所以認(rèn)為Kanlow品種更適合該轉(zhuǎn)化體系。

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