UPLC-MS-MS法檢測(cè)辣椒及其制品和肉醬中的羅丹明B含量

周海珍 臧永軍 唐菊 曹艷云

摘?要：建立了辣椒及其制品和肉醬中羅丹明B含量的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)方法。樣品經(jīng)乙腈提取后，經(jīng)中性氧化鋁固相萃取柱凈化，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)。本方法定量限0.1?μg/kg，線性范圍0.2～50?ng/mL；在羅丹明B添加水平0.1～10?μg/kg時(shí)，辣椒片樣品中的回收率76%～92%，辣椒制品中的回收率74%～93%，肉醬樣品中的回收率70%～90%。

關(guān)鍵詞：羅丹明B；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用；辣椒及其制品；肉醬

Determination of Rhodamine B in Hot Pepper and Its Products as well as Meat Sauce by UPLC-MS-MS

ZHOU Hai-zhen, ZANG Yong-jun, TANG Jun, CAO Yan-yun

(Technical Center, Shineway Group Co. Ltd., Luohe 462003, China)

Abstract: A method for the determination of rhodamine B in hot pepper and its processed products as well as meat sauce by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS-MS) was established. Samples were extracted with acetonitrile, then cleaned up with a neutral aluminum oxide solid-phase extraction cartridge, and detected by UPLC-MS-MS. The limit of quantitation (LOQ) was 0.1 μg/kg, and the calibration curve was linear in the range of 0.2 to 50 ng/mL for this method. At spiked levels of 0.1–10 μg/kg, the recoveries of rhodamine B ranged from 76% to 92% in hot pepper, from 74% to 93% in hot pepper products, and from 70% to 90% in meat sauce.

Key words: rhodamine B; UPLC-MS/MS; hot pepper and its products; meat sauce

中圖分類號(hào)：TS252.7文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2014）02-0022-03

羅丹明B，又名玫瑰紅B、堿性玫瑰精，是一種具有鮮桃紅色的人工合成染料，通常用在皮革加工、有色玻璃、煙花制造等工業(yè)領(lǐng)域[1-2]。因羅丹明B的著色效果好，色澤鮮亮，也被不法商家應(yīng)用于辣椒及其制品和調(diào)味醬等的染色。有研究表明：羅丹明B對(duì)人體具有潛在的致癌性[2-4]，因此禁止用作食品添加劑。

目前，羅丹明B的檢測(cè)方法主要包括液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[5-9]、

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS-MS）[10]等，前處理方法主要包括凝膠滲透色譜（gel permeation chromatography，GPC）凈化和固相萃?。╯olid phase extraction，SPE）凈化等方法。由于GPC凈化比較費(fèi)時(shí)，且產(chǎn)生大量廢液；而文獻(xiàn)中的固相萃取法主要采用C18柱、HLB柱或MCX柱，成本較高[11-13]。本實(shí)驗(yàn)采用自制中性氧化鋁柱凈化，具有成本低、凈化效果好等優(yōu)點(diǎn)，結(jié)合UPLC-MS-MS

的定性定量準(zhǔn)確、快速等優(yōu)勢(shì)[14-19]，建立了一種應(yīng)用UPLC-MS-MS法測(cè)定復(fù)雜基質(zhì)辣椒及其制品和肉醬中羅丹明B含量的定性定量分析和確證方法，以期為復(fù)雜基質(zhì)中羅丹明B的測(cè)定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)品（純度95%） 美國(guó)Sigma公司；乙腈、甲酸 美國(guó)Fisher公司；甲酸銨 美國(guó)Alfa Aesar公司；中性氧化鋁固相萃取柱 自制；辣椒片、辣椒制品、肉醬 市售。

1.2 儀器與設(shè)備

Xevo TQ MS超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)Waters公司；電子天平 瑞士Mettler Toledo公司；VX-III型多管平行振蕩器 北京Targin公司；KQ-500DE型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；GL-21M型離心機(jī) 湖南湘儀離心機(jī)有限公司；氮?dú)獍l(fā)生器 英國(guó)Peak公司；N-EVAP112型氮吹儀 德國(guó)OA-SYS公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)裝置 日本Eyela公司；固相萃取裝置 美國(guó)Waters公司。

1.3 方法

1.3.1?標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取10.53?mg羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)品于100?mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混勻，即為100?μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，避光儲(chǔ)存于4?℃冰箱中。

標(biāo)準(zhǔn)中間液：準(zhǔn)確吸取1.00?mL?質(zhì)量濃度為100?μg/mL

羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于100?mL容量瓶中，用甲醇定容，混勻，即為1.0?μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液，避光儲(chǔ)存于4?℃冰箱中。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)系列

用乙腈將羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)中間液稀釋成0.2、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0?ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列。

1.3.3 樣品處理[5-10]

樣品提?。悍Q取處理均勻的樣品（2.00±0.01）g于50?mL聚丙烯離心管中，加入10?mL乙腈，于多管平行振蕩器上振蕩提取30?min，超聲提取15?min，7000?r/min

離心5?min，取全部上清液轉(zhuǎn)入另一50?mL離心管中，待凈化。

樣品凈化：在固相萃取管底部裝上篩板，裝入3.0?g經(jīng)135?℃烘干4?h的中性氧化鋁基準(zhǔn)試劑，在氧化鋁上層加蓋篩板，固定柱體。將提取液全部通過(guò)自制氧化鋁柱，用5?mL丙酮淋洗，抽干；用10?mL乙腈∶水為9∶1

（V/V）混合溶液洗脫，洗脫液于50?℃氮吹儀上揮發(fā)至干，用1?mL質(zhì)譜純乙腈復(fù)溶，超聲溶解后過(guò)0.45?μm有機(jī)濾膜，濾液待測(cè)。

1.3.4 液相色譜條件

Waters BEH-C18?柱（2.1×50?mm，1.7μm）；柱溫40?℃；進(jìn)樣量5?μL；流動(dòng)相A：5?mmol/L甲酸銨+0.1%甲酸水溶液；B：乙腈。洗脫梯度：初始流動(dòng)相B為10%，0～2?min，B的比例等度變?yōu)?0%，3?min回到初始流動(dòng)相并保持1?min，總分析時(shí)間為4?min。

1.3.5 質(zhì)譜條件

采用ESI+多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）模式，電離電壓3.0?kV，源溫150?℃，霧化氣溫度450?℃，霧化氣流量900?L/h，錐孔氣流量20?L/h，碰撞氣為高純氬氣。經(jīng)優(yōu)化，羅丹明B的母離子m/z 443.43，錐孔電壓40?V，定量離子對(duì)m/z 443.43/399.30，碰撞能

35eV，定性離子對(duì)m/z 443.43/355.28，碰撞能45 eV。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取試劑選擇

實(shí)驗(yàn)分別選用正己烷、乙腈和乙酸乙酯∶環(huán)己烷為1∶1（V/V）作為提取試劑，按1.3.3節(jié)進(jìn)行前處理，結(jié)果表明，采用乙酸乙酯∶環(huán)己烷為1∶1（V/V）提取后的樣液顏色很深，可能是因?yàn)槔苯芳捌渲破泛腿忉u中的非極性雜質(zhì)被充分提取，經(jīng)氧化鋁柱凈化后樣液顏色仍較深，樣品的基質(zhì)效應(yīng)較為嚴(yán)重，回收率相對(duì)較低；而采用乙腈提取時(shí)，羅丹明B能得到充分的提取，油脂類等非極性雜質(zhì)在乙腈中溶解較少，凈化后上機(jī)樣液基本無(wú)色，樣品受基質(zhì)影響較小，回收率較高，所以，最終選用乙腈作為提取試劑。

2.2 洗脫液選擇

選用135 ℃烘干活化4 h后中性氧化鋁作為固相萃取填料，上樣和淋洗時(shí)盡可能減少水的引入，洗脫時(shí)將水按體積比加入乙腈或甲醇中，氧化鋁填料經(jīng)水去活化后將目標(biāo)物洗脫下來(lái)。結(jié)果表明，水＋乙腈的組合洗脫效果優(yōu)于水＋甲醇的組合洗脫效果，而當(dāng)水∶乙腈的比例為1∶9（V/V）時(shí)，羅丹明B已被完全洗脫，且大部分極性雜質(zhì)被氧化鋁柱截留，所以最終選用水∶乙腈為1∶9（V/V）作為洗脫液。

2.3 質(zhì)譜條件優(yōu)化

羅丹明B在ESI+電離模式下易得到H+形成較為穩(wěn)定的[M+H]+的分子離子，本實(shí)驗(yàn)對(duì)1?μg/mL羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全掃描和子離子掃描，獲得羅丹明B的母離子掃描圖和特征碎片離子掃描圖（圖1），選擇豐度比最強(qiáng)的碎片離子對(duì)m/z 443.43/399.30為定量離子對(duì)，豐度比較強(qiáng)的離子對(duì)m/z 443.43/355.28為定性離子對(duì)。

圖 1 羅丹明B的母離子掃描圖（A）和子離子掃描圖（B）

Fig.1 Parent ion scan (A) and fragment ion scan (B) spectra of rhodamine B

2.4 線性方程和定量限

分別以定量離子峰面積y對(duì)含量x作標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為y=1342.4x＋18.4，相關(guān)系數(shù)r=0.998。以RSN=10為定量限，羅丹明B的定量限為0.2?μg/mL；采用陰性樣品中添加目標(biāo)化合物的方法，按1.3.3節(jié)方法進(jìn)行前處理，得到本方法的樣品定量限為0.1?μg/kg。加標(biāo)量為0.1?μg/kg時(shí)辣椒和肉醬中羅丹明B的總離子流圖和定量離子色譜圖如圖2所示。

a、b分別為辣椒、肉醬中羅丹明B總離子流圖；

c、d分別為辣椒、肉醬中羅丹明B定量離子色譜圖。

圖 2 辣椒和肉醬中羅丹明B的總離子流圖和定量離子色譜圖

Fig.2 Total ion chromatogram and quantitative ion chromatogram of rhodamine B in hot pepper products and meat sauce

2.5 加標(biāo)回收率和精密度

由表1所示，羅丹明B在辣椒片樣品中的回收率76%～92%，RSD 3.6%～5.8%，在辣椒制品中的回收率74%～93%，RSD 3.1%～9.0%，在肉醬樣品中的回收率70%～90%，RSD 3.3%～9.5%。

3 結(jié)?論

本實(shí)驗(yàn)研究了復(fù)雜基質(zhì)辣椒及其制品和肉醬中羅丹明B含量的檢測(cè)方法，采用乙腈提取，自制中性氧化鋁柱凈化，水∶乙腈為1∶9（V/V）的溶液洗脫，UPLC-MS/MS測(cè)定。本方法定量限0.1?μg/kg，線性范圍0.2～50?ng/mL，在辣椒片樣品中的回收率76%～92%；辣椒制品中的回收率74%～93%；肉醬樣品中的回收率70%～90%。本方法檢測(cè)靈敏度高，雜峰干擾小，檢出限低，適用于辣椒及其制品和肉醬中羅丹明B含量的定性定量分析和確證。

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