DHMEQ對降植烷誘導(dǎo)的狼瘡性腎炎的作用及機制研究

曲惠青+朱燁+高樂俊+張力

[摘要] 目的 探討NF-κB抑制劑DHMEQ對降植烷誘導(dǎo)狼瘡性腎炎小鼠模型的作用。方法 方便選取2012年7月—2015年12月用降植烷誘導(dǎo)形成狼瘡性腎炎動物模型24例，研究DHMEQ對該模型的治療效果，探討DHMEQ對狼瘡性腎炎的影響。結(jié)果 DHMEQ拮抗升高的抗核小體，抗dsDNA抗體和抗組蛋白自身抗體以及 IL-1β，IL-6和IL-17以及TNF-α起到拮抗作用。DHMEQ可降低降植烷誘發(fā)的腎臟病變。磷酸化p38促分裂原活化蛋白激酶 （MAPK），磷酸化c Jun氨基末端激酶（JNK）和NFκBp65的腎表達水平（MAPK）顯著下調(diào)。結(jié)論 DHMEQ通過調(diào)節(jié)細胞因子水平和MAPK/ JNK/ NFκB信號通路對降植烷誘導(dǎo)狼瘡性腎炎產(chǎn)生有利影響。

[關(guān)鍵詞] 狼瘡性腎炎；NF κB；脫氫環(huán)氧甲基醌霉素（DHMEQ）

[中圖分類號] R4 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-0742（2016）12（a）-0027-04

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）是一種以體液自身免疫引起細胞和先天免疫反應(yīng)為特征的自身免疫性疾病的原型[1]。狼瘡性腎炎（LN）與SLE的不良預(yù)后相關(guān)。雖然激素聯(lián)合免疫抑制劑顯著改善了狼瘡性腎炎患者的預(yù)后，但是也增加了感染和腫瘤的發(fā)生幾率，因此急需新的治療手段。NFκB作為參與免疫應(yīng)答調(diào)控的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在多個研究中發(fā)現(xiàn)其參與自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展[2]。NF κB在很多信號通路[3]的交匯點發(fā)揮作用。因此，通過抑制NFκB信號通路可以改善狼瘡性腎炎[4]。從2012年7月—2015年12月，選取BALB/c 小鼠24例，通過降植烷誘導(dǎo)形成狼瘡性腎炎動物模型24例，研究DHMEQ對該模型的治療效果，探討DHMEQ對狼瘡性腎炎的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雌性BALB/ c小鼠[年齡8周，體重（18±2）g]24只由山東大學(xué)實驗動物中心提供。該研究經(jīng)過濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 實驗方法

雌性BALB/ c小鼠，隨機分為對照組和DHMEQ治療組（n=12）。小鼠8周齡注射降植烷，16周齡后給予腹腔注射終濃度1.2 mg/mL DHMEQ或配藥液，3次/周，持續(xù)注射16周，直到小鼠達到32周齡。分別于8周，16周和32周采集尾靜脈血檢測自身抗體的水平。小鼠于32周時頸椎脫臼法處死并取腎臟組織用于免疫學(xué)檢測和鏡下檢測。

1.3 自身抗體檢測

用酶聯(lián)免疫測定法（ELISA）對血清IgG抗核小體抗體，dsDNA和組蛋白水平進行檢測。流式細胞術(shù)來檢測小鼠IL-1β，IL-6和IL-17以及TNF-α的水平。

1.4 腎功能評估

為了評估尿蛋白排泄量，將小鼠置于代謝籠中并于24 h內(nèi)收集尿樣?？捡R斯亮藍法測定蛋白濃度。獲取處死小鼠后，取腎臟切片以及年齡匹配的C57BL/6對照小鼠，用Olympus BX60顯微鏡進行分析。用Image J軟件對染色強度進行定量分析。

1.5 腎臟蛋白質(zhì)印跡分析

蛋白提取使用RIPA試劑。上樣量為20 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳。電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。2% BSA封閉后，孵育于1∶2 000稀釋的一抗檢測p p38 MAPK，p JNK或 NF κB p65，使用HRP二抗，ECL發(fā)光液顯色后，通過圖像分析系統(tǒng)進行定量。GAPDH作為對照。

1.6 統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。對數(shù)據(jù)進行t檢驗和單因素方差檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DHMEQ降低抗dsDNA抗體，抗核小體和抗組蛋白抗體的血清水平

在16周和32周，對照組的血清dsDNA抗體水平明顯增加。與對照組相比，DHMEQ組dsDNA抗體水平在32周明顯降低（圖1A）。同樣， DHMEQ組的血清抗核小體和抗組蛋白抗體水平在32周時也顯著下降（圖1B和C）。

2.2 DHMEQ減少炎性細胞因子的表達作用

對照組的IL-1β，IL-6和IL-17以及TNF-α的水平明顯增加。DHMEQ治療組的細胞因子水平幾乎正常，明顯低于對照組（P <0.05，圖2）。

2.3 DHMEQ降低降植烷誘導(dǎo)狼瘡小鼠中的狼瘡性腎炎

在32周時（24周內(nèi)給予降植烷注射），DHMEQ組的尿蛋白排泄量較對照組明顯降低。另外， DHMEQ組的腎臟HE染色切片顯示腎小球損傷小于對照組（圖3B）。

2.4 DHMEQ抑制腎臟NF -κB和JNK/ P38 MAPK信號通路

NFκB p65蛋白作為NFκB信號活化的指標(biāo)，經(jīng)DHMEQ處理后下調(diào)。而且降植烷誘導(dǎo)狼瘡小鼠中的JNK磷酸化水平和p38蛋白在小鼠腎組織的水平明顯降低。

3 討論

DHMEQ是由擬無枝酸菌屬的菌種發(fā)酵純化制得的抗生素。與其他NF-κB抑制劑靶向IκBα的磷酸化水平不同，DHMEQ抑制NF-κB的組成部分p65的核轉(zhuǎn)位 8。DHMEQ在動物中未表現(xiàn)出明顯的毒性[7-8]，表明該化合物的安全性。該研究發(fā)現(xiàn)DHMEQ可以拮抗狼瘡中不斷增加的抗核小體，抗dsDNA抗體和抗組蛋白抗體，以及TNF-α，IL-1β，IL-6和IL-17水平。此外，可顯著減少降植烷引起的腎臟病變，表現(xiàn)為降低蛋白尿和腎小球病理變化的降低。 p38MAPK， p JNK和NF - κBp65的腎表達水平被顯著下調(diào)。上述研究結(jié)果表明，DHMEQ通過調(diào)節(jié)細胞因子水平和MAPK/ JNK/ NFκB信號通路對降植烷誘導(dǎo)的狼瘡性腎炎產(chǎn)生有利影響。

NF-κB活化基礎(chǔ)水平的升高與慢性炎癥性疾病[9]相關(guān)聯(lián)。NFκB家族的轉(zhuǎn)錄因子是由抑制劑，包括IκBα來調(diào)節(jié)的。與野生型小鼠相比，易感狼瘡小鼠的脾臟和樹突狀（DC）細胞中發(fā)現(xiàn)IκBα的表達水平較低，表明NFκB在狼瘡小鼠中異?；罨?。NFκB可以影響DC的功能并調(diào)節(jié)其適應(yīng)性免疫4的能力。現(xiàn)已證實，在實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）中[10]觀察到NFκB阻滯干擾不必要的T細胞應(yīng)答。此外，在自發(fā)狼瘡模型MRL / lpr小鼠中，抑制NFκB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)證明對LN有效[11]。該研究提供了新的證據(jù)表明NFκB的藥物抑制在降植烷誘導(dǎo)狼瘡小鼠中可能顯著降低狼瘡疾病的不良影響。

越來越多的證據(jù)表明NFκB參與自身反應(yīng)性T和B淋巴細胞發(fā)育，存活和增殖，并通過細胞因子（包括TNF-α，IL-1，IL-6和IL-17）參與維持慢性炎癥。因此，NFκB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可能有助于SLE的器官損傷11。在該研究中我們發(fā)現(xiàn)DHMEQ能夠拮抗不斷提高的IL-1β，IL-6和IL-17和腫瘤壞死因子α水平。此外，一些研究表明p38 MAPK/JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在調(diào)節(jié)細胞和體液免疫應(yīng)答[12-13]中起重要作用?，F(xiàn)已證明DHMEQ作為p38 MAPK的特異性抑制劑，在SLE的MRL/lpr小鼠模型中是有效的，表現(xiàn)為能夠改善腎功能和減少組織學(xué)損傷[13]。該研究的發(fā)現(xiàn)，通過DHMEQ處理能夠抑制MAPK/JNK信號傳導(dǎo)途徑。這些結(jié)果表明，DHMEQ通過阻斷NFκB/ MAPK/JNK介導(dǎo)的炎性反應(yīng)在SLE中發(fā)揮治療作用。

總之，該研究的結(jié)果表明DHMEQ通過調(diào)節(jié)細胞因子水平和MAPK/ JNK/ NFκB信號通路對降植烷誘導(dǎo)狼瘡性腎炎產(chǎn)生有利影響。該結(jié)果支持了NFκB阻滯可能是減少有害的自身免疫反應(yīng)的重要藥物方法的假設(shè)。

[參考文獻]

[1] Yang J， Yang X， Zou H， et al. Oxidative stress and treg and Th17 dysfunction in systemic lupus erythematosus[J]. Oxid Med Cell Longev，2016，2016：25-174.

[2] Ghosh S， Dass JF. Study of pathway cross-talk interactions with NF-κB leading to its activation via ubiquitination or phosphorylation： A Brief Review [J].Gene，2016，584（1）：97-109.

[3] Russo MA， Sansone L， Carnevale I， et al.One special question to start with： can HIF/NFkB Be A target in inflammation[J].Endocr Metab Immune Disord Drug Targets，2015， 15（3）：171-185.

[4] Kalergis AM， Iruretagoyena MI， Barrientos MJ， et al. Modulation of nuclear factor-kappaB activity can influence the susceptibility to systemic lupus erythematosus[J].Immunology，2009，128（1 Suppl）： e306-e314.

[5] Gruber S， Hendrikx T， Tsiantoulas D，et al.sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin G promotes atherosclerosis and liver inflammation by suppressing the protective functions of B-1 Cells[J]. Cell Rep，2016，14（10）：2348-2361.

[6] Mak A， Kow NY. The pathology of T cells in systemic lupus erythematosus[J]. J Immunol Res，2014，2014：419029.

[7] El-Salhy M， Umezawa K. Effects of AP 1 and NF κB inhibitors on colonic endocrine cells in rats with TNBS induced colitis [J]. Mol Med Rep，2016，14（2）：1515-1522.

[8] Ukaji T， Umezawa K. Novel. Approaches to target NF-κB and other signaling pathways in cancer Stem cells[J]. Adv Biol Regul，2014，56：108-115.

[9] Laz r DC， T ban S， Cornianu M， et al.New advances in Targeted gastric cancer treatment[J].World J Gastroenterol，2016，22（30）：6776-6799.

[10] Bertoglio JC， Baumgartner M， Palma R， et al.BMC neurol[J].2016，23：16，77.

[11] Jiang T， Tian F， Zheng H， et al. Nrf2 suppresses lupus nephritis through inhibition of oxidative injury and the NF-κB-mediated inflammatory response[J]. Kidney Int，2014，85：333-343.

[12] Mavropoulos A， Rigopoulou EI， Liaskos C. Bogdanos DP and sakkas LI： The role of p38 MAPK in the aetiopathogenesis of psoriasis and psoriatic Arthritis[J]. Clin Dev Immunol，2013，56（97）：51-201.

[13] Jin N， Wang Q， Zhang X， et al. The selective p38 mitogen-activated protein kinase inhibitor， SB203580， improves renal disease in MRL/lpr mouse Model of systemic Lupus[J]. Int Immunopharmacol，2011，11：1319-1326.

（收稿日期：2016-09-08）