茶葉籽油及茶皂素復(fù)合提取工藝研究

王曉琴　黃伙水　陳明　陳曉旭

摘 要 采用果膠酶開展水酶法提取茶葉籽油及茶皂素工藝研究，單因素實驗探索酶量、作用溫度、作用時間、料液比等對油得率及副產(chǎn)物茶皂素得率的影響；在此基礎(chǔ)上開展中心組合試驗，進行響應(yīng)面分析對提取工藝進行優(yōu)化。結(jié)果表明：回歸方程為R=-61.384+0.719A+2.994B+4.829C+3.475D+0.015AB+0.075AD+0.045BC+0.065BD-0.122A2-0.040B2-0.913C2-0.663D2；最佳工藝條件為酶解溫度45 ℃、 酶解時間3.8 h、 料液比1 ∶ 5.3（g ∶ mL）、果膠酶添加量7.3 mL（0.2%），驗證試驗茶葉籽油得率為27.0%，為茶葉籽資源開發(fā)提供了基礎(chǔ)資料。

關(guān)鍵詞 茶葉籽油；水酶法；果膠酶；茶皂素；響應(yīng)面分析

中圖分類號 TS225.16 文獻標(biāo)識碼 A

2009年茶葉籽油被中國衛(wèi)生部批準(zhǔn)為新資源食品，Guo等[1]報道其主要含有20種脂肪酸，其中單不飽和脂肪酸的平均含量為51.06%，主要為油酸；多不飽和脂肪酸平均含量為27.86%，主要為亞油酸；飽和脂肪酸平均含量為20.67%，主要為棕櫚酸和硬脂酸。另外茶葉籽油中富含多酚及生育酚（VE）等，具有較強的抗氧化能力。可見，茶葉籽油是一種可以與橄欖油媲美的食用油脂[2]。

水酶法是一種較為先進的提取工藝，“綠色、安全、高效”，在黃粉蟲、花生、核桃、葡萄籽、橄欖等多種油料開發(fā)研究上已見報道，表明其對油料作物綜合開發(fā)具有突出技術(shù)優(yōu)勢，可以提高油脂品質(zhì)[3-9]。植物細(xì)胞壁主要由纖維素及果膠組成，采用降解酶破壞油料細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，可促進細(xì)胞中油脂釋放。纖維素酶應(yīng)用于水酶法提取茶葉籽油筆者已做探索[10]，本研究采用果膠酶開展茶葉籽油提取工藝分析，單因素試驗探索不同條件對油得率及副產(chǎn)物茶皂素得率的影響，在此基礎(chǔ)上開展中心組合實驗，采用響應(yīng)面分析方法建立茶葉籽油水酶法提取工藝數(shù)學(xué)模型，旨在為茶葉籽綜合開發(fā)提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品材料：鐵觀音茶葉籽，采自安溪茶園。

試劑：果膠酶，北京索萊寶科技有限公司；無水乙醚、硫酸：國際集團化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇：北京宗榮寶科技有限公司；香蘭素、香草醛：阿拉丁公司。

主要儀器：DF-I集熱式磁力攪拌器：江蘇省榮華儀器制造有限公司；RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；SHZ-D（III）循環(huán)水式真空泵：上海賀德實驗設(shè)備有限公司；V-1200型可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 提取工藝流程 茶葉籽→干燥→去殼→脫衣→粉碎→稱量→滅酶→冷卻→酶解→二次滅酶→

油樣→抽濾→稱重

離心→分液

廢棄液→茶皂素濃度及體積測定

1.2.2 單因素實驗 果膠酶量對油得率和茶皂素得率影響：固定料液比為1 ∶ 4（g ∶ mL）、酶解溫度45 ℃、酶解時間2.5 h，考察1、4、7、10、13 mL果膠酶酶溶液（0.2%）對油得率的影響，同時對提取工藝副產(chǎn)物茶皂素得率進行測定。

料液比對油得率和茶皂素得率影響：固定酶用量7 mL、 酶解溫度45 ℃、酶解時間2.5 h，考察料液比（g ∶ mL）1 ∶ 2、1 ∶ 3、1 ∶ 4、1 ∶ 5及1 ∶ 6對油得率的影響，同時對提取工藝副產(chǎn)物茶皂素進行測定。

溫度對油得率和茶皂素得率影響：固定酶用量7 mL、料液比1 ∶ 4、酶解時間2.5 h，考察酶解溫度35、40、45、50、55 ℃對油得率的影響，同時對提取工藝副產(chǎn)物茶皂素進行測定。

酶解時間對油得率和茶皂素得率影響：固定酶用量7 mL、料液比1 ∶ 4、酶解溫度45 ℃，考察酶解時間0.5、1.5、2.5、3.5、4.5 h對油得率的影響，同時對提取工藝副產(chǎn)物茶皂素進行測定。

1.2.3 中心組合實驗 根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，在單因素試驗基礎(chǔ)上，確定中心組合實驗因素與水平，見表1。

1.2.4 測定方法 得油率/%=×100 （1）

其中：m1—提取的茶葉籽油質(zhì)量（g）

m2—茶葉籽粉質(zhì)量（g）

茶皂素測定采用香草醛一硫酸法[11]。

茶皂素/%=×100 （2）

其中：C—通過標(biāo)準(zhǔn)曲線由吸光度計算出此時茶皂素的濃度

V—測定時吸取的體積數(shù)

N—稀釋倍數(shù)

M—被測樣品重量

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用軟件Excel 2007和Design Expert 7.1.6進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 果膠酶用量對茶葉籽油和茶皂素得率的影響

由圖1可知，隨著果膠酶量增加，細(xì)胞壁降解程度加大，茶葉籽細(xì)胞中的油脂更多被釋放出來，油得率在酶溶液1～7 mL呈現(xiàn)逐漸上升，在酶溶液添加量為7 mL時，油得率達到最大值24.5%，酶量繼續(xù)增加導(dǎo)致底物相對減少，油得率的變化趨勢不明顯；在不同酶量條件下脫脂茶葉籽餅粕中所含茶皂素得率變化較小，隨著反應(yīng)酶量的增加，茶皂素得率曲線近似表現(xiàn)為一條逐漸上升的直線，變化幅度不大但趨勢明顯。因此，選擇加酶量7 mL為最佳條件。

2.2 酶解溫度對茶葉籽油和茶皂素得率的影響

由圖2可知，隨著反應(yīng)溫度增加，油得率先逐漸上升，酶解溫度為45 ℃時，油得率達到24.2%，隨著反應(yīng)溫度的繼續(xù)增加，油得率又呈現(xiàn)出逐漸降低的趨勢；不同溫度條件下脫脂茶葉籽餅粕中所含茶皂素得率存在變化，隨著反應(yīng)溫度的增加，茶皂素得率呈現(xiàn)逐漸上升趨勢，變化幅度較小。

2.3 料液比對茶葉籽油和茶皂素得率的影響

由圖3可知，隨著料液比的改變，漿料得以稀釋，酶與底物接觸面積增大，作用效果明顯提高，在料液比為1 ∶ 5時油得率達到最大值；而當(dāng)繼續(xù)增加反應(yīng)體系內(nèi)水分含量時，底物濃度變低，致使酶解效果減弱從而油得率下降；不同料液比條件下茶皂素得率變化幅度較大，當(dāng)增加反應(yīng)體系水分時，發(fā)揮了水浸法提取茶皂素的作用，料液比在1 ∶ 5、1 ∶ 6情況下茶皂素得率提高較大，最高達到9.4%?？梢娏弦罕冗m宜控制在1 ∶ 5。

2.4 酶解時間對茶葉籽油和茶皂素得率的影響

由圖4可知，隨著反應(yīng)時間增加，油得率呈現(xiàn)出先逐漸上升，當(dāng)反應(yīng)時間達到3.5 h，油得率接近最大值，隨著反應(yīng)時間繼續(xù)增加，油得率較為穩(wěn)定；在不同反應(yīng)時間條件下茶皂素得率整體偏低，隨著反應(yīng)時間的增加，茶皂素得率曲線呈現(xiàn)上升趨勢，但沒有出現(xiàn)峰值。為縮短時間、降低能耗，酶反應(yīng)時間取3.5 h為宜。

2.5 中心組合試驗結(jié)果分析

以茶葉籽油得率為響應(yīng)值，應(yīng)用 Design Expert7.1.6軟件對中心組合試驗29組試驗數(shù)據(jù)（表2）進行多元回歸擬合分析，得到茶葉籽油得率與各因素變量的二次方程模型為：

R=-61.384+0.719A+2.994B+4.829C+3.475D+0.015AB+0.075AD+0.045BC+0.065BD-0.122A2-0.040B2-0.913C2-0.663D2

其中，R代表茶葉籽油得率預(yù)測值，A代表酶量，B代表反應(yīng)溫度，C代表反應(yīng)時間，D代表料液比。

對以上回歸方程進行回歸系數(shù)的估計及方差分析（表3），料液比和反應(yīng)時間均達到極顯著水平（p<0.000 1），酶用量對茶葉籽油得率的影響顯著（p<0.05），且二次項對茶葉籽油得率的曲面效應(yīng)極顯著，p值均小于0.000 1，交叉項對得率的影響也較顯著，p值均小于0.05。

決定系數(shù) R2=0.979 3，即回歸方程中所有自變量的變化可以解釋97.93%的因變量變化，調(diào)整后的R2Adj=0.963 7，說明方程模型具有很高的可信度。從表3分析結(jié)果來看，整體模型p<0.000 1，表明該二次方程模型達到極顯著水平，并且失擬項不顯著，說明該方程與試驗的擬合度較好。因此，可以用該回歸方程代替試驗真實點對試驗結(jié)果進行分析。

為了進一步確定果膠酶提取茶葉籽油的最佳工藝條件，對擬合的方程分別求4個變量的一階偏導(dǎo)，并令其值為0，得到如下四元一次方程組：

0=0.719+0.015B+0.075D-0.244A

0=2.994+0.015A+0.045C+0.065D-0.080B

0=4.829+0.045B-1.825C

0=3.475+0.075A+0.065B-1.325D

對上述方程組求解可得最佳工藝實際參數(shù)為：酶解溫度45.19 ℃、酶解時間3.76 h、料液比1 ∶ 5.25（g ∶ mL）、果膠酶添加量7.33 mL（0.2%）。在此優(yōu)化條件下，茶葉籽油得率的預(yù)測值達到27.11%。為驗證該工藝條件的可靠性及預(yù)測值得準(zhǔn)確性，按照以上條件結(jié)合操作可行性進行3組驗證試驗，試驗結(jié)果如表4所示，相對誤差只有0.4%。

3 討論與結(jié)論

果膠是細(xì)胞壁的重要組成成分，果膠酶通過降解果膠從而破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，有助于油脂等物質(zhì)提取。溫度對酶促反應(yīng)的速率影響較大，包括影響酶的穩(wěn)定程度、酶與底物的結(jié)合，酶和輔酶的結(jié)合等[12]。當(dāng)溫度高于45 ℃，較高的溫度會抑制酶活性，從而導(dǎo)致油得率下降。在料液比為1 ∶ 2、1 ∶ 3的情況下，可能因為漿料粘稠度大，酶與底物接觸不充分，由于過高的底物濃度，2個或者2個以上的底物分子分別占據(jù)酶分子部分的活性點，從而使酶的活性受到抑制[12]。采用果膠酶對茶葉籽油及茶皂素進行提取，單因素試驗表明可實現(xiàn)綜合開發(fā)，中心組合試驗以及響應(yīng)面分析對該工藝進行優(yōu)化，最佳工藝條件是酶解溫度45 ℃、酶解時間3.8 h、料液比1 ∶ 5.3、果膠酶添加量7.3 mL（0.2%）。在此優(yōu)化條件下，驗證試驗茶葉籽油得率平均為27.0%。 本研究結(jié)果表明，果膠酶在茶葉籽油及茶皂素水酶法提取工藝具有一定應(yīng)用潛力。在茶葉籽油水酶法提取工藝中，采用果膠酶油脂得率略高于纖維素酶（23.8%）[10]、中性蛋白酶（26.1%）[13]，然而其降解體系水油乳化現(xiàn)象嚴(yán)重，清油難以分離，制約其在水酶法提取油脂工藝上的推廣價值，需要進一步探索解決破乳問題。

參考文獻

[1] Guo H， Zhou JP， Luo JW. Determination of the composition of fatty acids from tea seed oil[J]. Journal of Zhejiang University（Agric.&Life Sci.）， 2010， 36（2）： 212-220.

[2] 曾益坤. 茶葉籽制油及綜合開發(fā)利用[J]. 中國油脂， 2006， 31（1）： 69-71.

[3] 張立佳， 張建新，王臨賓. 水酶法提取黃粉蟲油工藝優(yōu)化[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 2010， 36（1）： 168-170.

[4] 江利華， 華 娣， 王 璋，等. 水酶法從花生中提取油與水解蛋白的中試研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 2009， 35（9）： 147-150.

[5] 史雙枝， 劉憶冬， 李 疆，等. 水酶法同時提取核桃仁油脂及水解蛋白的工藝研究[J]. 中國食品添加劑， 2010， 25（1）： 131-135

[6] 羅勤貴， 李 勁， 歐陽韶暉，等. 水酶法提取核桃油工藝的研究[J]. 中國食品學(xué)報， 2008， 8（6）： 58-62.

[7] Szydlowska-Czerniak A， Karlovits G. Effect of enzymatic and hydrothermal treatments of rapeseeds on quality of the pressed rapeseed oils： partⅡ. Oil yield and oxidative stability[J]. Process Biochemistry， 2010， 45（2）： 247-258.

[8] Szydlowska-Czerniak A， Karlovits G. Effect of enzymatic and hydrothermal treatments of rapeseeds on quality of the pressed rapeseed oils： Part Ⅰ. Antioxidant capacity and antioxidant content[J]. Process Biochemistry， 2010， 45（1）： 7-17.

[9] Hadj-Taieb N， Grati N. Optimisation of olive oil extraction and minor compounds content of Tunisian olive oil using enzymatic formulations during malaxation[J]. Biochemical Engineering Journal， 2012， 62（3）： 79-85.

[10] 王曉琴. 水酶法提取茶葉籽油及副產(chǎn)物茶皂素工藝研究[J]. 中國糧油學(xué)報， 2011， 26（11）： 78-82

[11] 傅春玲， 洪奇華， 阮 輝， 等. 茶皂素定量測定方法的研究[J]. 杭州大學(xué)學(xué)報， 1997， 24（3）： 239-241

[12] 鄭穗平， 郭 勇， 潘 力. 酶學(xué)[M]. 北京： 科學(xué)出版社， 2009： 144-145

[13] 王曉琴. 響應(yīng)面分析水酶法提取茶葉籽油工藝優(yōu)化研究[J]. 中國糧油學(xué)報， 2013， 28（5）： 40-43.