西瓜未成熟胚高效再生體系的建立

董焱 張潔 張海英 宮國義 郭紹貴 任毅 許勇

摘 要：為了建立西瓜高效遺傳轉(zhuǎn)化的再生體系，以西瓜雜交品種‘秀玲、自交系‘97103和野生種質(zhì)‘PI296341的未成熟胚為外植體，分析了基因型、未成熟胚發(fā)育時間和植物生長調(diào)節(jié)劑等因素對體外再生率的影響，獲得了西瓜離體培養(yǎng)再生植株。結(jié)果表明，以授粉后24 d的西瓜未成熟胚為外植體，在MS＋SH維生素＋6-BA 2.2 mg·L-1培養(yǎng)基上，‘秀玲、‘97103和‘PI296341的未成熟胚外植體能夠誘導(dǎo)出不定芽，不定芽誘導(dǎo)率為87.78%、82.78% 和86.11%，不定芽在MS＋SH維生素＋6-BA 0.2 mg·L-1＋IAA 0.02 mg·L-1培養(yǎng)基上伸長、展葉，在MS＋IBA 1.0 mg·L-1的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根得到完整的再生植株。以未成熟胚為外植體獲得再生植株的途徑，可為西瓜遺傳轉(zhuǎn)化提供有效的受體系統(tǒng)。

關(guān)鍵詞： 西瓜； 未成熟胚； 再生

Plant Regeneration from Immature Embryos of Watermelon

DONG Yan1，2， ZHANG Jie2， ZHANG Hai-ying2， GONG Guo-yi2， GUO Shao-gui2， REN Yi2， XU Yong1，2

（1.Plant Science and Technology College， Beijing University of Agriculture， Beijing 102206 China； 2. Beijing Vegetable Research Center， Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences， Beijing 100097 China）

Abstract：In order to obtain watermelon regeneration system for genetic transformation，the immature embryos of watermelon ‘Feeling，‘97103and‘PI296341were taken as explants in this experiment. The impact the immature embryo development time，genotypes and plant growth regulators on the rate of regeneration were explored and regenerated plantlets were obtained. Adventitious buds were regenerated in MS＋SH Vitamin＋6-BA 2.2 mg·L-1，and the regeneration rates were 87.78%，82.78% and 86.11% for 3 genotypes tested. The regenerated buds grew into shoots in the MS medium with 6-BA 0.2 mg·L-1＋IAA 0.02 mg·L-1，and rooted in MS+IBA 1.0 mg·L-1. The result indicated that the plantlet regeneration system from immature embryos can be a proper system for genetic transformation in watermelon.

Key words： Watermelon； Immature embryos； Regeneration

西瓜（Citrullus lanatus）為葫蘆科（Cucurbitaceae）西瓜屬一年生草本蔓生植物，是一種重要的園藝作物。西瓜遺傳基礎(chǔ)狹窄，種質(zhì)資源缺乏，很多重要的性狀無法通過常規(guī)育種方法進行改良。基因工程技術(shù)就成為對常規(guī)育種的有效補充手段。近年來，植物基因工程的理論和實踐逐步走向成熟和完善，并成為現(xiàn)代生物技術(shù)的核心領(lǐng)域，亦是農(nóng)作物品種改良的重要手段。轉(zhuǎn)基因能夠定向改良西瓜性狀，并且是基因功能驗證的重要手段，而開展這些工作的前提是建立西瓜高效體外再生系統(tǒng)。

國內(nèi)外許多學(xué)者已經(jīng)相繼采用頂芽[1]、子葉[2]、下胚軸[3]、花藥[4]和原生質(zhì)體[5]等進行西瓜組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)。但是與番茄等園藝植物相比，西瓜體外再生能力弱、不容易通過愈傷組織途徑獲得再生植株，存在著高效基因型少、再生頻率低、分化芽伸長慢、易出現(xiàn)玻璃化苗等問題[6-8]，此外，不同研究者所得的結(jié)論存在很大的差異，重復(fù)性差，目前還缺乏對西瓜體外再生技術(shù)的系統(tǒng)研究。這嚴重制約著基因工程技術(shù)在西瓜遺傳改良與基因功能驗證中的應(yīng)用。

不同研究結(jié)果表明，基因型和外植體類型是影響體外再生效率的決定性因素[9-10]。此外，植物生長調(diào)節(jié)劑的配比對再生率也有顯著影響[11]。本試驗首次采用西瓜未成熟胚為外植體材料，分析了未成熟胚發(fā)育時間、基因型和植物生長調(diào)節(jié)等因素對再生率的影響，建立了穩(wěn)定、高效的西瓜離體再生體系，可以成為遺傳轉(zhuǎn)化體系有效的受體系統(tǒng)，為推動西瓜轉(zhuǎn)基因研究奠定堅實的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

西瓜雜交品種‘秀玲購于臺灣農(nóng)友種苗公司，西瓜自交系‘97103、西瓜野生種質(zhì)‘PI296341由北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心西瓜育種實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 外植體的獲得 采集授粉后18~30 d 的西瓜于75% 乙醇中浸泡消毒10 min，在超凈臺中火焰滅菌后，用無菌刀取出種子，于無菌水中清洗3次，在濾紙上吸干水分；切去種殼，將未成熟胚生長點切除，靠近生長點切去0.5 cm×0.5 cm切塊，再沿主脈切成兩半。

1.2.2 不定芽出芽誘導(dǎo) 將外植體接種到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，含有SH維生素[12]，3% 的蔗糖和0.7% 的瓊脂。不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+6-BA 2.2 mg·L-1（培養(yǎng)基1）和不定芽伸長培養(yǎng)基MS+6-BA 0.2 mg·L-1+IAA 0.02 mg·L-1（培養(yǎng)基2），至不定芽長到5~8 cm（表1）。培養(yǎng)溫度為（28±2）℃，光周期為16 h，光照強度為20 000 lx左右。4周以后觀察外植體的生長情況。

1.2.3 幼苗生根誘導(dǎo) 切取完整幼苗，轉(zhuǎn)入MS+

IBA 1.0 mg·L-1培養(yǎng)基（培養(yǎng)基3）中誘導(dǎo)生根，2周左右可獲得生根植株，或進行試管苗嫁接得到完整植株（表1）。

表1 西瓜未成熟胚再生苗誘導(dǎo)培養(yǎng)基編號

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 設(shè)置3組獨立重復(fù)試驗，統(tǒng)計每組重復(fù)中誘導(dǎo)形成不定芽的外植體數(shù)量，將不定芽誘導(dǎo)率（誘導(dǎo)率/%=出芽外植體數(shù)量/總外植體數(shù)量×100）和不定芽成苗率（成苗率/%=成苗不定芽數(shù)量/總不定芽數(shù)量×100）作為評價西瓜再生率的指標，對數(shù)據(jù)進行平均值（Mean）和標準差（SD）計算及顯著差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 西瓜未成熟胚發(fā)育時間對不定芽誘導(dǎo)及發(fā)生途徑的影響

采集授粉后18~30 d的西瓜‘秀玲新鮮果實，將種子未成熟胚用于離體再生試驗。結(jié)果顯示：授粉后18 d的西瓜種子種皮呈白色，內(nèi)部扁平，沒有種仁或種仁很小呈水狀（圖版-1、4），這種幼胚不能用做外植體。授粉后20~24 d的西瓜，隨著授粉時間增加，未成熟胚外植體的不定芽誘導(dǎo)率上升（表2）。授粉后24 d的西瓜種子飽滿，種皮白色透著粉紅色，幼胚水嫩且沒有完全成熟（圖版-2、5），這種未成熟胚作為外植體最有利于誘導(dǎo)形成不定芽，在不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中外植體四周都能誘導(dǎo)出不定芽，且一個外植體能誘導(dǎo)2~4個不定芽（圖版-9、10）。授粉后30 d的西瓜種子種皮已經(jīng)全部木質(zhì)化變成褐色，幼胚趨于成熟（圖版-3、6），授粉時間大于24 d的種子幼胚，不定芽誘導(dǎo)率下降（表2），且只有靠近生長點的部分能誘導(dǎo)出不定芽（圖版-11、12、13）。

表2 不同未成熟胚成熟時間對

不定芽誘導(dǎo)率的影響

[注] 表中同列數(shù)字后不同小寫字母表示差異顯著（P=0.05），品種為‘秀玲，后表同。

2.2 不同品種（系）西瓜的未成熟胚不定芽的誘導(dǎo)率

為了進一步明確不同基因型的未成熟胚不定芽的誘導(dǎo)率，本試驗對供試3個西瓜品種（系），雜交品種‘秀玲、自交系‘97103和野生種質(zhì)‘PI296341的授粉后24 d的未成熟胚，進行不定芽誘導(dǎo)試驗。試驗結(jié)果表明3個品種（系）平均不定芽誘導(dǎo)率分別為87.78%、82.78%和86.11%（表3）。說明以未成熟胚為外植體建立的西瓜再生體系對基因型的依賴性不強。因此，以未成熟胚為遺傳轉(zhuǎn)化的受體，有望克服其品種局限性。

表3 不同品種（系）西瓜未成胚不定芽的誘導(dǎo)率

2.3 植物生長調(diào)節(jié)劑對未成熟胚不定芽誘導(dǎo)的影響

將西瓜未成熟胚外植體接入含有不同質(zhì)量濃度6-BA（1.4~2.4 mg·L-1）的培養(yǎng)基上，白色的胚漸漸轉(zhuǎn)綠（圖版-7、8），7 d后完全呈現(xiàn)綠色，光滑表面逐漸變得粗糙，形成擬分生組織，14 d后擬分生組織發(fā)育為多個凸起的不定芽（圖版-16）。隨著6-BA濃度增高，未成熟胚外植體不定芽誘導(dǎo)率升高（表4），但是形成畸形芽的概率也同樣增高（表5），易造成密集叢生芽（圖版-14）和玻璃化現(xiàn)象（圖版-15）。試驗結(jié)果顯示：6-BA質(zhì)量濃度為2.2 mg·L-1和2.4 mg·L-1時，不定芽誘導(dǎo)率差異不顯著，而畸形芽誘導(dǎo)率差異顯著，說明6-BA質(zhì)量濃度為2.2 mg·L-1時，最有利于不定芽的誘導(dǎo)。

表4 不同質(zhì)量濃度6-BA對西瓜

不定芽誘導(dǎo)率的影響

表5 不同質(zhì)量濃度6-BA對西瓜

不定芽畸形現(xiàn)象的影響

[注] 畸形芽率/%=形成畸形芽的外植體數(shù)量/總外植體數(shù)量×100。

2.4 植物生長調(diào)節(jié)劑對未成熟胚不定芽伸長的影響

將不定芽轉(zhuǎn)入含有較低質(zhì)量濃度6-BA（0~0.4 mg·L-1）和一定質(zhì)量濃度IAA（0~0.04 mg·L-1）的培養(yǎng)基中伸長、展葉（圖版-17），試驗結(jié)果表明，含有6-BA 0.2 mg·L-1＋IAA 0.02 mg·L-1的培養(yǎng)基中的未成熟胚外植體不定芽成苗率最高（表6、圖版-18）。植物生長調(diào)節(jié)劑濃度過低，不定芽伸長緩慢，不利于成苗，而高濃度的IAA會抑制不定芽伸長成苗，不定芽易橫向生長形成叢生芽。

3 討論與結(jié)論

3.1 不同品種對西瓜未成熟胚離體再生沒有顯著影響

基因型是影響植物體外再生的內(nèi)在因素，過去20 a（年）的體外再生研究表明西瓜體外再生有很強的基因型依賴性[13-14]，由此導(dǎo)致西瓜再生體系的品種局限性。西瓜再生研究以子葉等為外植體的居多，不同西瓜品種子葉外植體的誘導(dǎo)率差異很大。Compton等[15]以不同品種子葉外植體為材料進行研究，發(fā)現(xiàn)其不定芽率有很大差別，目前大多數(shù)相關(guān)研究均支持這一結(jié)論。Suratman等[16]利用二倍體和三倍體西瓜子葉外植體進行體外再生試驗，結(jié)果三倍體比二倍體西瓜的不定芽誘導(dǎo)效果更好。Akashi等[17]利用野生西瓜子葉外植體進行體外再生體系的研究，發(fā)現(xiàn)西瓜野生品種（Citrullus lanatus sp.）比西瓜栽培品種（Citrullus lanatus cv.）更有利于組織培養(yǎng)。Nunˇez-Palenius等[13-14]以52種商業(yè)西甜瓜品種子葉外植體進行研究，其中能夠誘導(dǎo)出不定芽的品種為供試品種的12.5%。本試驗供試3個西瓜品種（系），雜交品種‘秀玲、自交系‘97103和野生種質(zhì)‘PI296341的未成熟胚都能夠形成再生植株，且不定芽誘導(dǎo)率相差不明顯。說明以未成熟胚為外植體建立的西瓜再生體系對基因型的依賴性不強?？梢娛诜酆?4 d的未成熟胚細胞還具有一定的分化能力，而子葉等其他形式的外植體細胞分化程度比較高，脫分化能力受基因型影響較大。因此，以未成熟胚為遺傳轉(zhuǎn)化的受體，有望克服其品種局限性。

3.2 西瓜未成熟胚的發(fā)育時間是影響西瓜離體再生的關(guān)鍵因素

西瓜成熟種子采集后進入休眠期，經(jīng)過長時間貯藏，解除休眠后萌發(fā)的種子，再生率下降，不利于不定芽的誘導(dǎo)。因此，西瓜種子經(jīng)過貯藏后，形成成熟的胚芽，成熟胚除胚芽、胚根生長點處的細胞外，分生能力、分化能力均比不成熟胚細胞下降，因此不利于不定芽的誘導(dǎo)。本試驗對授粉后18~30 d的西瓜種子未成熟胚外植體進行體外再生試驗研究，發(fā)現(xiàn)授粉后24 d的西瓜種子未成熟胚飽滿，活性最好，這種種子的未成熟胚最有利于不定芽的誘導(dǎo)，未成熟胚外植體四周都能誘導(dǎo)出芽，且一個外植體能誘導(dǎo)出2~4個不定芽，不定芽誘導(dǎo)率達到87.78%。授粉時間少于18 d的西瓜未成熟胚還沒開始發(fā)育，不能用于體外再生，隨著授粉時間的增加，未成熟胚成熟度增加，細胞分化能力降低，不定芽誘導(dǎo)率下降，且只有靠近生長點端能誘導(dǎo)出芽。

3.3 6-BA是西瓜離體再生必需的植物生長調(diào)節(jié)劑

細胞分裂素是細胞分化為完整植株的決定性外源激素，高濃度細胞分裂素能夠誘導(dǎo)組織進行脫分化形成愈傷組織，而在含有低濃度細胞分裂素和生長素的培養(yǎng)基上，不定芽能夠順利伸長并發(fā)育成植株。研究表明，6-BA的濃度對不定芽的誘導(dǎo)影響不是很大，且附加IAA會導(dǎo)致愈傷組織過度生長而抑制不定芽的分化。玉米素也有類似的效果[18]。但也有不同結(jié)論，郝立新和王懷名[19]報道，將西瓜子葉接種到MS+5.0 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 IAA培養(yǎng)基上，最有利于不定芽的誘導(dǎo)。Choi[1]等將西瓜子葉在僅附加1.0 mg·L-16-BA的MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)不定芽。王春霞等[20]將西瓜子葉接種到MS鹽類+維生素B5+1.0 mg·L-1 6-BA+0.2 mg·L-1 IAA培養(yǎng)基上，子葉的出芽率最高?？傊?，由西瓜子葉誘導(dǎo)不定芽，6-BA是至關(guān)重要的，其質(zhì)量濃度一般為1.0~5.0 mg·L-1。6-BA質(zhì)量濃度過高會加劇試管苗的玻璃化，Vedat等[18]研究表明超過4 mg·L-16-BA或者KT會引起不定芽的畸形和嚴重玻璃化。西瓜組織培養(yǎng)過程中玻璃化現(xiàn)象極為普遍，幾乎不可避免[21]，甚至可以導(dǎo)致整個工作的失敗。培養(yǎng)基和激素類型、瓊脂濃度、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、通氣情況等均與此有關(guān)。

低濃度的6-BA附加一定濃度IAA的培養(yǎng)基則有利于不定芽伸長、展葉[22]。西瓜子葉誘導(dǎo)不定芽常常形成芽叢，要經(jīng)過芽伸長后才能分化成完整植株。湯紹虎等[23]將頂芽誘導(dǎo)的叢生芽轉(zhuǎn)入MS+2.0 mg·L-1 6-BA+1.0 mg·L-1 IAA+2.0 mg·L-1 GA3培養(yǎng)基上，半個月內(nèi)芽大部分伸長20~30 mm，而且生長健壯。萬勇等[24]認為MS附加0.5 mg·L-1BA＋1.0 mg·L-1 IAA為最佳繼代增殖培養(yǎng)基。而張志忠等[25]將叢生芽分株移入MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 IBA的培養(yǎng)基上獲得很好的伸長效果。本試驗在含有2.2 mg·L-16-BA的培養(yǎng)基上能夠誘導(dǎo)西瓜未成熟胚形成不定芽。在含較低質(zhì)量濃度0.2 mg·L-1 6-BA和0.02 mg·L-1 IAA的培養(yǎng)基上伸長、展葉，從而得到更多有價值的再生植株。

這種以未成熟胚為外植體獲得再生植株的途徑，解決了以西瓜子葉、胚根等為外植體再生體系的基因型依賴性強、誘導(dǎo)率低、重復(fù)率低等問題，可以為遺傳轉(zhuǎn)化提供有效的受體系統(tǒng)，因此有廣闊的利用前景。（本文圖版見彩插21版）

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收稿日期： 2014-03-21； 修回日期： 2014-03-27

基金項目： 國家863計劃項目（2012AA100103）； 國家科技支撐項目（2012BAD50G01、2012BAD02B03、2013BAD01B04）

作者簡介： 董 焱，女，在讀碩士研究生，研究方向為蔬菜遺傳育種與生物技術(shù)。電話： 13520777405； 電子信箱： dongyan575@163.com

通信作者： 許 勇，男，研究員，研究方向為蔬菜遺傳育種與生物技術(shù)。電話： 010-51503199； 電子郵箱： xuyong@nercv.org