采用高效液相色譜法測定金銀花中綠原酸含量方法探討

管曉琴 孫 鵬 朱佳麗 祖若玉 曹冬梅

【摘 要】 目的 探討采用高效液相色譜法測定金銀花中綠原酸含量的方法，總結(jié)實驗方法。方法 建立液相色譜條件：采用十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18柱），流動相為乙腈：0.4%磷酸溶液（13∶87），檢測波長在327nm，流動相流速為1ml/min。結(jié)果 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品在0.025mg/ml-0.2mg/ml范圍內(nèi)線性良好，線性系數(shù)r=0.9999，樣品回收率達(dá)95.80%，精密度RSD=0.07%。結(jié)論 采用該方法能簡單、快速、準(zhǔn)確檢測金銀花中綠原酸含量，且結(jié)果可靠，重現(xiàn)性好，可以作為醫(yī)療上控制金銀花量的依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 高效液相色譜法；金銀花；綠原酸；測定

【中圖分類號】 R282.6 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】 A

金銀花用于醫(yī)學(xué)界具有悠久的歷史，是一種清熱解毒、涼散風(fēng)熱的中藥材，常用于治療咽喉疼痛、嗓子干啞、風(fēng)熱感冒等癥狀。現(xiàn)代研究證明，金銀花中發(fā)揮抗菌、抗病毒作用的主要是一種生物活性成分—綠原酸，因此，有效、準(zhǔn)確的檢測綠原酸含量成為判斷金銀花品質(zhì)的關(guān)鍵[1]。本文研究了采用高效液相色譜法測定金銀花中綠原酸含量的方法，為綠原酸的提取及檢測積累了一定的經(jīng)驗，現(xiàn)記錄如下：

1 材料與方法

1.1 材料 原料：金銀花來自省藥材站，放置于陰涼處，陰干至恒重，粉碎，過四號篩，作為樣品備用；綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品購于中國藥品生物制品檢定所，純度達(dá)96.6%；乙腈為色譜純、乙醇為分析純。儀器：Agilent1200高效液相色譜，UV—2401PC光度計，電子天平，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

1.2 方法

1.2.1 對照品與樣品溶液制備 ①對照品溶液的制備：精密稱取置五氧化二磷減壓干燥器中干燥12小時的綠原酸對照品約20mg，置100ml棕色量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5ml，置25ml棕色量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得40μg/ml的對照標(biāo)準(zhǔn)品溶液，（10℃以下保存）。②樣品溶液的制備：取金銀花，粉碎，過四號篩，取約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50ml，稱定重量，超聲處理（KQ-500B超聲儀，功率250W，頻率35kHz）30分鐘，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾，精密量取續(xù)濾液5ml，置25ml棕色量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，即得。

1.2.2 確定檢測波長 取0.2ml備用溶液于25ml容量瓶中，甲醇定容，UV—2401PC光度計光譜掃描，選取最大吸收波長為高效液相檢測波長，即327nm處。

1.2.3 色譜條件 色譜柱：C18柱（4.6mm150mm），流動相：乙腈：0.4%磷酸溶液（13∶87），流速：1ml/min，進(jìn)樣量：10μl，柱溫：30℃，檢測波長：327nm，保留時間7min，外標(biāo)法測定。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品10.00mg，50%甲醇溶液溶解，并定容至25ml容量瓶，得0.4mg/ml溶液，分別稀釋成0.20mg/ml、0.15 mg/ml、0.10 mg/ml、0.05 mg/ml、0.025 mg/ml溶液。取各個濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液10μl進(jìn)樣，每個濃度平行進(jìn)3次，記錄濃度下峰值。

1.2.5 提取液中綠原酸含量計算 根據(jù)樣品液稀釋程度，計算公式如下：

式中，X代表綠原酸含量，Ax代表樣品中綠原酸峰面積，As代表標(biāo)準(zhǔn)溶液中綠原酸峰面積，Mx代表標(biāo)準(zhǔn)樣品質(zhì)量，Ms代表金銀花質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 光譜掃描 綠原酸在327nm處具有特征吸收峰，UV—2401PC光度計光譜在波長500-100nm范圍內(nèi)連續(xù)掃描提取液，發(fā)現(xiàn)提取液在327nm處有較強的吸收峰，因此我們確定提取液中含有綠原酸。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 不同稀釋濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)樣，HPLC檢測，讀取峰面積值，取三次的平均值，如表1所示。以峰面積為縱坐標(biāo)，以綠原酸含量為橫坐標(biāo)作圖，圖1所示。

計算得回歸方程為Y= 320062X - 552.76，相關(guān)系數(shù)R2=0.9999，表明該液相色譜條件下，綠原酸在0.025mg/ml-0.2mg/ml范圍內(nèi)具有良好的線性。

2.3 方法的回收率 稱取不同質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)品，分別加入樣品備用溶液，在上述同樣色譜條件下檢測其綠原酸含量。采用加標(biāo)準(zhǔn)品的樣品測定結(jié)果減去未添加標(biāo)準(zhǔn)品的樣品測定結(jié)果，計算標(biāo)準(zhǔn)品的回收率，結(jié)果如表2。方法的平均回收率為95.80%。

2.4 方法的精密度 取0.10 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣6次，計算6次的平均值及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，觀察該方法的精密度，如表3所示。標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對偏差為0.07%。

2.5 方法的穩(wěn)定性 綠原酸在光照下不穩(wěn)定，取0.10 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液于棕色瓶中避光保存，分別于0、1、2、5、10、20小時時測定樣品的含量，測定結(jié)果如表4所示。平均峰值31054.5，標(biāo)準(zhǔn)偏差0.04%，結(jié)果表明綠原酸在避光下保存，20小時內(nèi)基本穩(wěn)定。

3 討論

金銀花又名忍冬，名字最早出自《本草綱目》，由于該花初為白色，隨著時間延長，慢慢變?yōu)辄S色，因此得名金銀花，一般在三月開花，花有微香。金銀花芳香透達(dá)，能祛邪，能宣散風(fēng)熱、清解血毒，可用于身熱、發(fā)斑、熱毒愴痛、發(fā)疹及咽喉腫痛等熱性病，可作為藥品、保健品、化妝品的原料[2]。

綠原酸為金銀花中一種重要的生物活性物質(zhì)，是金銀花抗菌、抗病毒等的功能成分。不同時期的金銀花中綠原酸含量有所不同，花蕾時期含量最高，至開放、枯萎，綠原酸含量呈下降趨勢，一般在6.07%-4.29%[3]。綠原酸在醫(yī)療上具有較強的藥理功能，能改善、修復(fù)人體消化系統(tǒng)以及血液系統(tǒng)，如綠原酸對人體急性咽喉炎癥等有顯著療效，此外，綠原酸還具有止血、抗病毒、增高白血球等作用。

目前，金銀花中綠原酸的提取方法主要有水提、醇提、薄層分析柱層析等，從經(jīng)濟、適用及安全各方面考慮，本文中用到的醇提方法提取率高，且提取過程中能有效的排除其他水溶性物質(zhì)成分的干擾，減少綠原酸損失率，為一種高效的提取方法[4]。

隨著科技的發(fā)展，對小分子功能成分的檢測技術(shù)及分析技術(shù)得到了很大提高，綠原酸的檢測從最初只能定性的定量法、比色法、分光光度計法等發(fā)展為不僅能夠定性還能準(zhǔn)確定量的高效液相色譜法。本文所用到的高效液相色譜法，不僅具有操作簡單、技術(shù)成熟等特點，還有對其目標(biāo)成分檢測的回收率高、精密度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點。

本文研究了高效液相色譜法分析測定金銀花中綠原酸含量，我們采用50%甲醇，選用KQ-500B超聲儀，在功率250W，頻率35kHz下超聲處理30分鐘，提取金銀花中綠原酸。通過紫外分光光度計掃描綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，發(fā)現(xiàn)其在327nm處具有最大吸收值，因此確定HPLC檢測波長，并建立高效液相色譜條件，色譜柱采用C18柱，流動相為乙腈：0.4%磷酸溶液（13∶87），流速為1ml/min，進(jìn)樣量為10μl，柱溫在30℃，檢測波長為327nm，在此色譜條件下能有效的檢測到綠原酸，樣品保留時間在7min，綠原酸與鄰近成分分離效果良好。并在0、1、2、5、10、20小時時分別測定樣品的含量，平均峰值31054.5，標(biāo)準(zhǔn)偏差0.04%，表明穩(wěn)定性良好。

目前，市場上金銀花品種眾多，然而其質(zhì)量、品質(zhì)差異巨大，甚至一些不良商家采用違法手段，如硫磺熏制，以改善花色品質(zhì)，然而其功效成分綠原酸含量很低。本文旨在建立完善的綠原酸提取、檢測方法，準(zhǔn)確測定金銀花中綠原酸的含量，監(jiān)督、控制金銀花品質(zhì)質(zhì)量，為人們高效利用金銀花提供了一定的參考價值。

參考文獻(xiàn)

[1] 聶凌鴻，岳淼.金銀花中綠原酸提取工藝的優(yōu)化[J].食品研究與開發(fā)，2008，29（1）：51-55.

[2] 國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（第一部）[M].化學(xué)工業(yè)出版社，2000，177.

[3] 周榮漢主編.中藥資源學(xué)[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，1993：426-433，179，85.

[4] 劉恩蕊，李青山.高效液相色譜法測定金銀花有效部位中綠原酸的含量[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2006，37（2）：166-168.