1種適用于轉(zhuǎn)基因玉米PCR檢測的DNA快速提取方法

戴軍　汪?！≈炖颉↑S大昉　郎志宏

摘要[目的]建立一種快速提取玉米基因組DNA的方法。[方法]對(duì)改良CTAB法進(jìn)行進(jìn)一步簡化，不需要進(jìn)行沉淀、洗滌、溶解和RNA消化等步驟，建立一種快速提取玉米基因組DNA的方法。[結(jié)果]該方法獲得的DNA完整性及PCR擴(kuò)增效果與試劑盒提取方法相比無明顯差異；經(jīng)過對(duì)樣品ELISA檢驗(yàn)可知，該方法得到的DNA用于PCR檢測結(jié)果準(zhǔn)確。[結(jié)論]該方法能夠滿足轉(zhuǎn)基因玉米PCR檢測中快速、高效、準(zhǔn)確、高通量的要求。

關(guān)鍵詞轉(zhuǎn)基因玉米；基因組DNA；快速提??；PCR檢測

中圖分類號(hào)S513文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）12-03494-03

基金項(xiàng)目轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)（批準(zhǔn)號(hào)：2013ZX08003-001）；國家自然科學(xué)基金（批準(zhǔn)號(hào)：30970231）。

作者簡介戴軍（1986-），男，湖北十堰人，碩士研究生，研究方向：植物分子生物學(xué)與基因工程。*通訊作者，研究員，從事植物基因工程研究。

玉米作為我國重要的糧食作物和工業(yè)原料，近年來需求不斷上升，我國已從玉米凈出口國轉(zhuǎn)變成凈進(jìn)口國，玉米自給率不斷下降[1]，糧食安全問題引起國人的注意。植物基因工程技術(shù)快速發(fā)展，為培育優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗逆的玉米新品種，滿足我國對(duì)玉米的需求，保證國家糧食安全提供了新方法[2]。在轉(zhuǎn)基因玉米研究和培育過程中，陽性植株的篩選、插入序列分析、安全檢測一般都離不開分子檢測，最常用的分子檢測手段是PCR檢測。PCR檢測的基礎(chǔ)是提取滿足檢測需要的基因組DNA。目前，高質(zhì)量的基因組DNA提取方法主要有CTAB法、SDS法、離心柱提取試劑盒法和磁珠提取試劑盒法[3-6]。但是前2種方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，后2種方法費(fèi)用較高[7]，都難以適用于轉(zhuǎn)基因植株檢測時(shí)大批量提取基因組DNA的要求。在研究或者篩選群體較大（如轉(zhuǎn)基因植株的大批量篩選、遺傳規(guī)律分析等）時(shí)，提取基因組DNA就會(huì)成為一項(xiàng)繁重的工作，并成為檢測和篩選速度的一個(gè)重要制約因素。因此出現(xiàn)了堿裂解法[8]和高溫水煮法[9]等一步法提取DNA的方法。這些簡易方法成本低、速度快，但是存在DNA提取質(zhì)量差、PCR效果不理想和保存時(shí)間短等問題。

筆者通過對(duì)改良CTAB法進(jìn)一步簡化，摸索出經(jīng)過2步處理得到用于PCR檢測的基因組DNA提取方法（簡稱“2步CTAB法”）；同時(shí)比較了離心柱試劑盒提取法和2步CTAB法在DNA提取質(zhì)量、耗費(fèi)時(shí)間、成本和PCR擴(kuò)增效果上的差異，并對(duì)PCR檢測結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，以期為大批量檢測PCR提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對(duì)象。材料為實(shí)驗(yàn)室獲得的轉(zhuǎn)Bt cry1Ah基因抗蟲材料A1和A2事件及非轉(zhuǎn)基因玉米自交系綜31。

1.1.2主要試劑。CTAB提取液（ CTAB 4 g，NaCl 16.364 g，1 mol/L TrisHCl 20 ml（ pH8.0），0.5 mol/L EDTA 8 ml，先用70 ml ddH2O溶解，再定容至200 ml滅菌）、氯仿/異戊醇（24∶1）、2×Taq mix和植物基因組DNA提取試劑盒，均購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；ELISA試劑盒，購自EnviroLogix公司。

1.2方法

1.2.12步CTAB法提取玉米基因組DNA。①取50～100 mg的玉米葉片，放入1.5 ml EP管中。將EP管放入液氮中，等取完所有的樣品后，用在液氮中快速冷凍過的玻璃棒將葉片研磨成粉末（大批量操作時(shí)可以在EP管中放入珠子，在自動(dòng)磨樣機(jī)上把樣品砸碎）。加入500 μl CTAB提取液，在65 ℃水浴10 min。②在水浴后的EP管中加入500 μl 氯仿/異戊醇（24∶1），振蕩混合，12 000 r/min離心5 min，取上清作為PCR模板。

1.2.2試劑盒法提取玉米基因組DNA。按照康為世紀(jì)公司《植物基因組DNA提取試劑盒使用說明書》進(jìn)行操作，最后溶解在100 μl ddH2O中。

1.2.3提取的基因組DNA完整性分析。在提取的DNA中加入0.5 μl RNase（10 mg/ml），37 ℃消化30 min，取5 μl提取的DNA，加入1 μl 6×loading buffer，1%的瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，在凝膠成像儀上觀察、成像。

1.2.4PCR檢測效果分析。將提取的DNA稀釋10倍，取1 μl為模板，外源基因cry1Ah的特異性引物F1：CGGATGGCAAATTGGAGGAG，R1：ACTTGAGGGAATGGCACGGGT，用于擴(kuò)增A1事件的cry1Ah基因片段。F2：GCATCTCCACCTACACCGACTA，R2：CGGCTGGAATCTGGGTAATC用于特異性擴(kuò)增A2事件的mcry1Ah基因片段。反應(yīng)體系如下：基因組DNA（ l μg/μl）0.5 μl，5′ primer（10 pmol/μl）0.25 μl，3′ primer（10 pmol/μ1）0.25 μl，2×Taq mix 10 μl，ddH2O 9 μl。擴(kuò)增條件如下：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，擴(kuò)增循環(huán)數(shù)30；最后72 ℃延伸2 min。

1.2.5對(duì)PCR檢測結(jié)果的驗(yàn)證。按照CTAB 2步法提取轉(zhuǎn)基因玉米A1和A2事件的基因組DNA，進(jìn)行PCR檢測。同時(shí)提取樣品的總蛋白，用ELISA的方法進(jìn)行對(duì)植株分離情況進(jìn)行鑒定，ELISA的操作方法按照操作說明進(jìn)行。

2結(jié)果與分析

2.1提取基因組DNA的完整性檢測將2步CTAB法和試劑盒法2種方法提取的基因組DNA在瓊脂糖凝膠上電泳檢測。圖1表明，這2種方法提取的DNA電泳條帶大小一致，未見有明顯的差異，也未見明顯的降解條帶，說明2步CTAB法提取的基因組DNA具有較好的完整性。

2.32種提取方法的時(shí)間和成本比較對(duì)試劑盒提取法和2步CTAB提取法的成本和提取時(shí)間進(jìn)行比較，分別以少量樣品（以8個(gè)樣品為例）和大量樣品（以100個(gè)樣品為例）2種情況。由表1可知，2步CTAB法的提取成本遠(yuǎn)低于試劑盒，提取所需要的時(shí)間也僅為試劑盒提取方法的1/4，在大批量操作時(shí)更具優(yōu)勢。

3結(jié)論與討論

從1996年的170萬hm2到2013年的1.75億hm2，全球轉(zhuǎn)基因作物的種植面積增加了100多倍，這使得轉(zhuǎn)基因技術(shù)成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)史上采用最為迅速的生物技術(shù)[10]。轉(zhuǎn)基因技術(shù)作為一項(xiàng)高新技術(shù)，受到世界各國高度重視?！稗D(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)”的實(shí)施，也為我國發(fā)展轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物研究提供了國家戰(zhàn)略支撐[11]。玉米作為我國重要的糧食和工業(yè)原料，獲得一批優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗逆的轉(zhuǎn)基因玉米是該“重大專項(xiàng)”的一個(gè)重要目標(biāo)之一。

在轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)化篩選過程中，一般都需要進(jìn)行大批量的PCR檢測，以確定陽性植株。對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因材料的后代進(jìn)行遺傳規(guī)律分析時(shí)，也需要一個(gè)比較大的檢測群體進(jìn)行PCR檢測。檢測的前提是提取質(zhì)量可靠、可用于PCR檢測的基因組DNA，現(xiàn)已有的一些提取方法雖然得到的基因組DNA質(zhì)量高，但提取步驟繁瑣，成本高，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，尤其是不適用于大批量的群體檢測[12]。實(shí)驗(yàn)室在篩選轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米的工作中摸索出一種適用于PCR檢測的玉米基因組DNA快速提取方法，該方法在改良的CTAB法的基礎(chǔ)上進(jìn)行進(jìn)一步簡化，不需要沉淀、干燥、溶解、RNase消化等步驟，大大簡化了操作過程，節(jié)省了操作時(shí)間。同時(shí)在CTAB的配方中不需要加入巰基乙醇，大大減少對(duì)人體的危害和對(duì)環(huán)境的污染。另外，簡化操作步驟還可以減少對(duì)基因組的損傷，減小操作過程污染的可能性，減少PCR檢測過程中出現(xiàn)的假陽性現(xiàn)象。經(jīng)過和試劑盒提取法比較和應(yīng)用ELISA的方法進(jìn)行檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其檢測效果與試劑盒提取法無差異，準(zhǔn)確度高，完全滿足常規(guī)的PCR檢測。實(shí)現(xiàn)了簡捷、快速、高效、高通量提取玉米基因組DNA的要求。

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