毛霉型豆豉中總DNA提取的比較研究

鐘燕　騫宇　李希宇　陳煉紅　索化夷

摘要[目的]對(duì)毛霉型豆豉中總DNA的提取方法進(jìn)行比較。[方法]選用常用的3種DNA提取方法（溶菌酶法、蛋白酶KCTAB（十六烷基三甲基溴化銨）法和改良溶菌酶法）提取發(fā)酵豆豉中的總DNA，并測(cè)定總DNA的純度，比較3種方法的優(yōu)劣。[結(jié)果]通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳對(duì)提取效果進(jìn)行觀察比較發(fā)現(xiàn)，蛋白酶KCTAB法提取豆豉中微生物的宏基因組DNA的純度最好，質(zhì)量最高。[結(jié)論]蛋白酶KCTAB法更適合豆豉這類發(fā)酵食品宏基因組DNA粗提取，可以作為豆豉宏基因組學(xué)研究的基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞DNA提??；豆豉；微生物；PCR

中圖分類號(hào)S188文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）12-03499-03

基金項(xiàng)目國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31201411）；西南大學(xué)博士基金項(xiàng)目（SWU112057）。

作者簡(jiǎn)介鐘燕（1994- ），女，湖南郴州人，本科，專業(yè)：食品質(zhì)量與安全。*通訊作者，副教授，博士，從事食品科學(xué)研究。

豆豉是我國(guó)漢族傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品，因其醇香濃郁，富于酯香，成品油潤(rùn)化渣，深受人們喜愛(ài)。在我國(guó)，豆豉除了供食用外，還有治療疾病的效果，歷代醫(yī)書(shū)都有豆豉治療疾病的記載，李時(shí)珍的《本草綱目》中則有“豆豉具開(kāi)胃增食、消食化滯、發(fā)汗解表、除煩喘等療效”的記載[1]?，F(xiàn)代科學(xué)表明，豆豉還有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，含有豐富的蛋白質(zhì)、糖，以及VB1，VB2和VE等[2]，同時(shí)含有多種功能成分，具有抗癌、溶解血栓、降血壓、抗氧化和抗菌等生理功能[3]。

但是，毛霉型豆豉的生產(chǎn)采用傳統(tǒng)自然發(fā)酵工藝，產(chǎn)品很難形成穩(wěn)定的質(zhì)量[4]。另外，傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉中的微生物區(qū)系復(fù)雜，大部分發(fā)酵豆豉中微生物起作用的機(jī)理仍需揭示[5]。對(duì)于豆豉微生物區(qū)系的研究是闡明豆豉成熟機(jī)制的重要組成部分，而現(xiàn)在主要采用非培養(yǎng)技術(shù)的方式進(jìn)行研究[6-7]，豆豉DNA的高質(zhì)量提取是這項(xiàng)技術(shù)研究的前提基礎(chǔ)。

永川毛霉型豆豉是我國(guó)傳統(tǒng)食品，因其健康美味、營(yíng)養(yǎng)豐富深受廣大消費(fèi)者喜愛(ài)。但豆豉形成過(guò)程中的微生物作用機(jī)理研究較少，豆豉形成品質(zhì)不穩(wěn)定。傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉的微生物區(qū)系復(fù)雜，大多選擇非培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行研究，而提取高質(zhì)量的DNA是非培養(yǎng)技術(shù)的前提條件。筆者通過(guò)對(duì)豆豉發(fā)酵的3種DNA提取方法的比較研究，尋求一種適合發(fā)酵食品穩(wěn)定可靠的DNA提取方法，以期為豆豉微生物后續(xù)研究提供參考和依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對(duì)象。處于不同發(fā)酵階段的永川毛霉型豆豉，為永川豆豉食品有限公司經(jīng)天然制曲發(fā)酵，原料大豆產(chǎn)地為吉林省。

1.1.2主要儀器。MiniPROTEAN Tetro Cell核酸電泳系統(tǒng)，購(gòu)自BioRAD公司；G：Box EF凝膠成像系統(tǒng)，購(gòu)自Syngene公司；XW20A多功能食品加工機(jī)，購(gòu)自鑫威電器有限公司；AIR TECH超凈工作臺(tái)，購(gòu)自蘇凈安泰公司；LDZX40BI立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器，購(gòu)自上海申安醫(yī)療器械廠；LX100手掌型離心機(jī)，購(gòu)自江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司；GL88B渦旋混合器，購(gòu)自江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司；UV755B可見(jiàn)紫外分光光度計(jì)，購(gòu)自上海分析儀器總廠；ZHWY211B恒溫培養(yǎng)振蕩器，購(gòu)自上海智誠(chéng)分析儀器有限公司；EDC810雙槽PCR儀，購(gòu)自東勝創(chuàng)新生物科技有限公司。

1.1.3主要試劑。氯仿、異戊醇、異丙醇、無(wú)水乙醇、氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸鈉、DNA染色劑等均為分析純，均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；溶菌酶、蛋白酶K、Marker、SDS、PEG、CTAB和TrisHcl，均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.2方法

1.2.1永川豆豉生產(chǎn)工藝流程。大豆篩選→浸泡→瀝干→常壓蒸料→冷卻→自然發(fā)酵制曲→翻曲→拌和（食鹽含量15%、醪糟、白酒）→入罐發(fā)酵后熟→成品。

1.2.2溶菌酶法粗提取DNA[8-9]。參照熊開(kāi)容從活性污泥中提取DNA的方法，改進(jìn)后使用[10]。取豆豉樣品5.000 g，在無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)移到15 ml的PBS（pH約7.0）中，攪拌后用4層紗布過(guò)濾，于30 ℃、120 r/min稀釋振蕩15 min，得到的溶液以2 000～3 000 r/min離心5 min，收集到的上清液再以14 000 r/min，4 ℃離心10 min；棄去上清液，用等體積的TES溶液洗滌1次，以14 000 r/min，4 ℃離心10 min，棄去上清液。

沉淀加入1.5 ml溶菌酶溶液，混合物在37 ℃下 225 r/min振蕩1 h；加入0.5 ml裂解緩沖液，0.5 ml磷酸鹽緩沖液，0.5 ml氯仿-異戊醇（24∶1，V/V）。離心管在漩渦混合器上3 000 r/min振蕩10 min，得到的裂解液以6 000 r/min離心3 min，上清液轉(zhuǎn)入另一離心管。向原管加入0.5 ml去離子水重新離心10 s，2 次離心的上清混合，9 000 r/min離心5 min，收集水相。水相加入0.6倍體積異丙醇沉淀1 h，12 000 r/min離心10 min；得到的沉淀以70%冰預(yù)冷的乙醇重復(fù)洗滌后風(fēng)干，溶于500 ml TE緩沖液。取100 μl作DNA濃度測(cè)定或其他分析，其余的貯存于-20 ℃。

1.2.3蛋白酶KCTAB法粗提取DNA。取豆豉樣品5.000 g，在無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)移到15 ml的PBS（ph 7.0）中，攪拌后用4層紗布過(guò)濾，30 ℃、120 r/min稀釋振蕩15 min。得到的溶液以2 000～3 000 r/min離心5 min，收集到的上清液再以14 000 r/min，4 ℃離心10 min，棄去上清液，用等體積的TES溶液洗滌1次，以14 000 r/min，4 ℃離心10 min，棄去上清液。

主要參照Z(yǔ)hou[11]的方法進(jìn)行試驗(yàn)，沉淀加入1.0 ml DNA提取液混合，然后加入20 μl 10 mmol/L的Protein K，37 ℃水浴并振蕩30 min，再加入150 μl SDS（20%），65 ℃水浴2 h，每20 min倒置1次；11 000 r/min 4 ℃離心分離5 min；將上清液轉(zhuǎn)移到新的5 ml離心管，沉淀再加入0.5 ml提取液和50 μl 10%SDS；渦旋振蕩后于65 ℃水浴10 min，11 000 r/min 4 ℃離心5 min，收集上清液合并于上次上清液。重復(fù)上述操作，3 次上清合并。上清液中加入等體積的氯仿-異戊醇（24∶1，V/V），顛倒混合；室溫6 000 r/min離心5 min，吸取上清液轉(zhuǎn)移至新的5 ml離心管中；水相加入0.6倍體積異丙醇沉淀1 h，于12 000 r/min離心10 min；沉淀以70%冰預(yù)冷的乙醇重復(fù)洗滌后風(fēng)干，溶于500 μl TE緩沖液。取100 μl作DNA濃度測(cè)定或其他分析，其余的貯存-20 ℃。

1.2.4改良溶菌酶法粗提取DNA。主要依據(jù)張瑞福[12]、王建玲[13]從土壤微生物中提取DNA的方法，改進(jìn)后使用。取5.000 g豆豉樣品，在無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)移到15 ml的磷酸鹽緩沖液中，振蕩2～3 min后，于5 000 r/min離心5 min，棄去上清液，重復(fù)洗滌樣品直至上清液基本清澈；再用15 ml磷酸鹽緩沖液洗滌，小心轉(zhuǎn)移洗滌液至另一離心管中；5 000 r/min再次離心5 min，棄去上清液。

取經(jīng)預(yù)處理的豆豉樣品，加入0.8 ml的溶菌酶溶液，5 μl蛋白酶K，混合物在37 ℃下200 r/min振蕩1 h，然后加入經(jīng)65 ℃預(yù)熱過(guò)的0.3 ml裂解緩沖液、0.3 ml磷酸鹽緩沖液和0.6 ml氯仿/異戊醇（24∶1，V/V），65 ℃水浴10 min，每隔2～3 min置漩渦振蕩儀上振蕩30 s，然后于5 000 r/min離心3 min，小心吸取上清轉(zhuǎn)入另一2 ml離心管，加入0.6倍體積異丙醇冰浴沉淀30 min，于15 000 r/min離心10 min，棄去液相；沉淀以1.0 ml 75%冷乙醇輕微振蕩洗滌，4 ℃下以13 000 r/min離心2 min，待乙醇徹底揮發(fā)后，加入500 μl TE緩沖液溶解DNA；取100 μl作DNA濃度測(cè)定或其他分析，其余的貯存-20 ℃。

1.2.5DNA的純度測(cè)定。采用紫外分光光度計(jì)直接檢測(cè)粗提取DNA的分光度，DNA的A260/A280值可以作為評(píng)價(jià)DNA純度的一個(gè)指標(biāo)。

1.2.6DNA的質(zhì)量測(cè)定。用50×TAE溶液配制0.7%瓊脂糖凝膠，使用Gold View核酸染料。吸取10 μl DNA溶液，加入1 μl的10×loading Buffer，混合均勻后依次加入點(diǎn)樣孔中，然后吸取5 μl的λDNA/HindⅢ Marker加入一端的點(diǎn)樣孔，在120 V恒定電壓下進(jìn)行電泳，電泳時(shí)間為50 min。電泳結(jié)束后在凝膠成像系統(tǒng)中觀察電泳結(jié)果并拍照、分析。

2結(jié)果與分析

2.1圖像分析圖1表明，3種不同細(xì)胞裂解方法所提取的DNA在Marker條帶的附近出線4條條帶，而且提取的DNA條帶完整性并不相同。根據(jù)圖像來(lái)看，3號(hào)和4號(hào)條帶的亮度強(qiáng)于溶菌酶和改良溶菌酶法的1號(hào)、2號(hào)、5號(hào)和6號(hào)的條帶，其中3號(hào)模板的條帶的亮度為最強(qiáng)，說(shuō)明該法所提取的DNA得率為最高。

注：M為λDNA/HindⅢ Marker；1～2為溶菌酶法；3～4為蛋白酶KCTAB法；5～6為改良溶菌酶法。

2.2不同方法提取的DNA濃度比較A260/A280值在1.8～1.9的范圍內(nèi)說(shuō)明DNA純度很高，A260/A280小于1.8說(shuō)明提取的DNA中含有一些蛋白質(zhì)和多酚，A260/A280大于1.9說(shuō)明提取的DNA中含有一些RNA；較純凈的核酸的A260/A230值大于2.0。另外，發(fā)酵豆豉中腐殖酸會(huì)影響A260吸光度，從而影響DNA純度[14]。

由表1可知，3號(hào)和4號(hào)的A260/A280值接近1.9，A260/A230值接近2.0，說(shuō)明3、4號(hào)樣品的DNA純度比較高，但有RNA污染；1號(hào)、2號(hào)的A260/A280值和A260/A230值都較低，說(shuō)明1號(hào)和2號(hào)樣品的DNA純度沒(méi)有3號(hào)和4號(hào)的高，有蛋白質(zhì)或多酚等的污染；5號(hào)和6號(hào)的A260/A280值和A260/A230值比1號(hào)和2號(hào)的更低，說(shuō)明5號(hào)和6號(hào)對(duì)應(yīng)的樣品DNA純度很低。

2.33種提取方法的比較由表2可知，在DNA的提取得率上，蛋白酶KCTAB法優(yōu)于溶菌酶法和改良后的溶菌酶法。提取后的DNA樣品分裝凍存在-20 ℃條件下1周后仍可以使用，基本無(wú)降解[15]。潘立等以曲霉菌為例，在蛋白酶KCTAB法的基礎(chǔ)上建立了一種快速提取絲狀真菌DNA的試驗(yàn)方法[18]。吳則東等通過(guò)對(duì)不同方法提取甜菜干種子的DNA進(jìn)行比較研究，發(fā)現(xiàn)CTAB法比堿裂解法能提取出更高質(zhì)量的DNA[16]。瓊脂糖凝膠電泳、紫外分光光度計(jì)顯示，在試驗(yàn)使用的3種方法中，蛋白酶KCTAB法是提取豆豉中總DNA的最理想的方法。

3結(jié)論

綜上所述，蛋白酶KCTAB法操作比較簡(jiǎn)單，瓊脂糖凝膠電泳顯示DNA得率和DNA質(zhì)量都較高。比較溶菌酶法和改良溶菌酶法，蛋白酶KCTAB法更適合豆豉這類發(fā)酵食品宏基因組DNA粗提取，可以作為豆豉宏基因組學(xué)研究的基礎(chǔ)。

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