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    水稻HLCMS細(xì)胞質(zhì)雄性不育基因的體外轉(zhuǎn)錄及Northern Blot檢測(cè)

    2014-04-29 14:37:14華宇峰劉京王春臺(tái)劉學(xué)群譚艷平
    安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014年12期
    關(guān)鍵詞:水稻

    華宇峰 劉京 王春臺(tái) 劉學(xué)群 譚艷平

    摘要[目的]通過(guò)基因克隆和體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)獲得水稻紅蓮型細(xì)胞質(zhì)雄性不育(HLCMS)不育系粵泰A(YTA)中的2個(gè)細(xì)胞質(zhì)雄性不育基因orf216和orfH79的RNA,為Northern Blot檢測(cè)提供陽(yáng)性定量標(biāo)準(zhǔn)品,并可作為凝膠阻滯試驗(yàn)的底物,用于研究與恢復(fù)基因編碼產(chǎn)物的相互作用,從而為闡釋不育基因與恢復(fù)基因的相互作用分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。[方法]以紅蓮型胞質(zhì)雄性不育基因orf216和orfH79的特異引物,利用不育系YTA為材料,PCR擴(kuò)增獲得相應(yīng)片段,分別連接至pGEM-T Easy質(zhì)粒并篩選陽(yáng)性重組質(zhì)粒,測(cè)序鑒定后酶切線(xiàn)性化,補(bǔ)平粘性末端,以rN4為底物、用依賴(lài)于DNA的 RNA聚合酶進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄,轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用DNase處理除去DNA模板,純化并測(cè)定RNA濃度,并用Northern Blot 驗(yàn)證。[結(jié)果]獲得了細(xì)胞質(zhì)雄性不育基因orf216和orfH79各自的RNA,經(jīng)檢測(cè)orf216濃度為1.286 μg/μl,A260/A280為2.01;orfH79濃度為1.006 μg/μl,A260/A280為2.10。[結(jié)論]運(yùn)用體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)獲得的RNA片段條帶單一,純度較高,可用于體外大量獲取目的RNA。

    關(guān)鍵詞水稻;紅蓮型細(xì)胞質(zhì)雄性不育;體外轉(zhuǎn)錄;Northern Blot

    中圖分類(lèi)號(hào)S511;Q37文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611(2014)12-03497-02

    基金項(xiàng)目國(guó)家自然基金項(xiàng)目(31170296)。

    作者簡(jiǎn)介華宇峰(1988- ),男,湖北黃岡人,碩士研究生,研究方向:植物分子生物學(xué)研究。*通訊作者,副教授,碩士生導(dǎo)師,博士,從事水稻功能基因方面的研究工作。

    植物細(xì)胞質(zhì)雄性不育(Cytoplasmic Male Sterile,CMS)現(xiàn)象在高等植物中普遍存在,是指植物雄性器官喪失功能,而雌性器官發(fā)育正常,表現(xiàn)為母性遺傳和花粉敗育的生物學(xué)現(xiàn)象[1]。Levings最早報(bào)道玉米CMS與細(xì)胞質(zhì)的線(xiàn)粒體基因組異常有關(guān),并以此提出線(xiàn)粒體DNA是導(dǎo)致CMS產(chǎn)生的載體[2]。在大多數(shù)情況下,CMS植株花粉敗育的發(fā)生與線(xiàn)粒體基因組分子內(nèi)或分子間頻繁重組所形成的嵌合基因有關(guān)[3],這種線(xiàn)粒體基因組的非正常重組產(chǎn)生嵌合開(kāi)放閱讀框最終導(dǎo)致了花粉敗育[4]。CMS導(dǎo)致的花粉敗育可以被恢復(fù)基因Rf所恢復(fù)。CMS/Rf系統(tǒng)減少了手工去雄的工作程序,因此,其在商業(yè)用雜交種子生產(chǎn)過(guò)程中就顯得尤為重要。CMS除了在農(nóng)業(yè)上的重要性之外,研究CMS的特性也為解析植物中線(xiàn)粒體基因和核基因在遺傳上的相互作用帶來(lái)了方便。

    Boro II(BT)、Honglian(HL)和Wild abortive(WA)是主要的3種胞質(zhì)雄性不育類(lèi)型,均用于三系雜交水稻的培育[5]。易平等以atp6為探針,采用同源系列法,證明了HLCMS線(xiàn)粒體基因組中atp6orfH79構(gòu)成的嵌合基因與CMS有關(guān)[6]。liu等克隆了一個(gè)與HLCMS相關(guān)的基因片段HLsp1[7]。李丕順通過(guò)TAILPCR獲得HLsp1側(cè)翼序列,并預(yù)測(cè)其下游有一個(gè)編碼216個(gè)氨基酸的開(kāi)放閱讀框orf216[8]。陳為等發(fā)現(xiàn)orf216的表達(dá)能導(dǎo)致花粉敗育[9]。

    體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)是在體外條件下合成RNA的過(guò)程。其基本原理是將目的基因片段連接到帶有噬菌體啟動(dòng)子的克隆載體下游,以構(gòu)建好的質(zhì)粒DNA或其線(xiàn)性化片段為模板,用依賴(lài)于DNA的RNA聚合酶,在4種核糖核酸存在條件下,體外轉(zhuǎn)錄生成目的RNA?,F(xiàn)已成為一種分子生物學(xué)技術(shù),用于制備RNA,目前已經(jīng)有商業(yè)化的試劑盒銷(xiāo)售。應(yīng)用體外轉(zhuǎn)錄體系合成的單鏈RNA可用于研究RNA的加工、RNA結(jié)構(gòu)特性及其翻譯;還可用于合成RNA雜交探針,靈敏度極高,特異性強(qiáng),優(yōu)于切口平移法獲到的探針[10]。筆者通過(guò)基因克隆和體外轉(zhuǎn)錄技術(shù),獲得水稻紅蓮型細(xì)胞質(zhì)雄性不育(HLCMS)不育系粵泰A(YTA)中的2個(gè)雄性不育基因orf216和orfH79各自對(duì)應(yīng)的mRNA,以期為進(jìn)一步研究orf216的分子作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

    1材料與方法

    1.1材料

    1.1.1研究對(duì)象。HLCMS不育系YTA植株和大腸桿菌DH5α,均由中南民族大學(xué)武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供,克隆載體pGEMT Easy Vector,購(gòu)自Promega公司。

    1.1.2主要試劑。限制性?xún)?nèi)切酶、rTaq DNA聚合酶、DNA Marker和T4 DNA連接酶,購(gòu)自TAKARA公司;T4 DNA 聚合酶,購(gòu)自碧云天公司;DNA凝膠回收試劑盒,購(gòu)自Axygen公司;SP6 RNA體外轉(zhuǎn)錄試劑盒,購(gòu)自Promega公司;North2South?Biotin Random Prime Labeling Kit、North2South Chemiluminescent Hybridization和Detection Kit,均購(gòu)自Thermo scientific公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)試劑分析純,市售。

    1.2方法

    1.2.1引物設(shè)計(jì)[6]。根據(jù)易平等發(fā)表的orfH79序列設(shè)計(jì)引物orfH79F/orfH79R,根據(jù)實(shí)驗(yàn)室克隆的orf216序列設(shè)計(jì)引物orf216F/orf216R。引物由南京金斯瑞公司合成。

    1.2.2載體構(gòu)建。取新鮮的水稻YTA葉片,用CTAB法提取基因組DNA,分別用orfH79和orf216的序列引物擴(kuò)增基因組DNA,獲得orfH79和orf216目的片段。將片段分別與克隆載體pGEMT Easy Vector 在體外進(jìn)行連接,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,涂布于藍(lán)白斑篩選平板上,于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱光照培養(yǎng)過(guò)夜。挑取白色菌落擴(kuò)大培養(yǎng),SDS堿裂解法提取培養(yǎng)菌株質(zhì)粒DNA,并用PCR擴(kuò)增檢測(cè)其是否為陽(yáng)性,檢測(cè)為陽(yáng)性者送南京金斯瑞公司測(cè)序驗(yàn)證。

    1.2.3體外轉(zhuǎn)錄。用限制性?xún)?nèi)切酶NcoI將測(cè)序正確的質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切,酶切產(chǎn)物純化后用T4 DNA 聚合酶將粘性末端補(bǔ)平,再一次純化,得到可用于體外轉(zhuǎn)錄的線(xiàn)性質(zhì)粒DNA。按照SP6 RNA體外轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)配制體外轉(zhuǎn)錄體系,進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄結(jié)束后,用RNasefree DNase消化模板質(zhì)粒DNA,純化產(chǎn)物,分別得到orfH79 mRNA和orf216 mRNA。nano drop儀(Thermo scientific公司,Nano Drop 2000)測(cè)定RNA濃度和純度,變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA產(chǎn)物。

    1.2.4Northern Blot檢測(cè)。應(yīng)用Northern Blot方法,利用生物素標(biāo)記的寡聚核苷酸作為探針,檢測(cè)所得到的RNA是否為特異的目標(biāo)RNA。

    2結(jié)果與分析

    2.1載體構(gòu)建以水稻紅蓮型細(xì)胞質(zhì)雄性不育(HLCMS)不育系粵泰A(YTA)為材料,利用特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增分別得到orfH79和orf216目的片段,轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),并對(duì)質(zhì)粒DNA進(jìn)行特異引物PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增結(jié)果為陽(yáng)性者送南京金斯瑞公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)果均正確。

    3討論

    基因的體外轉(zhuǎn)錄體系現(xiàn)在已經(jīng)廣泛用于RNA的制備。通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄,可以獲得多種RNA,包括SiRNA、tRNA及其他類(lèi)型的RNA,用于研究基因的表達(dá)調(diào)控,以及研究RNA的結(jié)構(gòu)和功能等。

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