玉米和擬南芥的原生質(zhì)體制備及瞬時表達體系的研究

趙蘇州　盧運明　張占路　趙楊敏　王磊

摘要[目的]優(yōu)化玉米和擬南芥原生質(zhì)體的制備條件及瞬時表達體系。[方法]以不同時期玉米葉片和擬南芥為材料分離原生質(zhì)體，通過對不同酶濃度，解離時間和滲透壓的研究，優(yōu)化最佳分離原生質(zhì)體體系；原生質(zhì)體再經(jīng)PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，通過GFP基因表達百分比鑒定原生質(zhì)體活性和轉(zhuǎn)化效率。[結(jié)果]玉米和擬南芥原生質(zhì)分離的最佳條件為：纖維素酶1.5%， 離析酶0.5%；擬南芥酶解4 h，甘露醇濃度0.4 mol/L；玉米酶解6 h，甘露醇濃度0.45～0.50 mol/L。最佳生長時期為：擬南芥6～8片葉；玉米二片葉。用去內(nèi)毒素質(zhì)粒經(jīng)PEG（玉米30% PEG，擬南芥40% PEG）誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化置于黑暗下培養(yǎng)，原生質(zhì)體活性和轉(zhuǎn)化效率較高，原生質(zhì)體中可以觀察到明顯的GFP熒光。[結(jié)論]玉米和擬南芥原生質(zhì)體的制備受酶濃度，解離時間和滲透壓的影響，在原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化過程中，質(zhì)粒DNA純度，PEG濃度等是影響轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵因素，與擬南芥原生質(zhì)體相比玉米原生質(zhì)體要穩(wěn)定性差一些。

關(guān)鍵詞玉米；原生質(zhì)體； 擬南芥

中圖分類號S513；Q819文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）12-03479-04

基金項目國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項（2011ZX08003-002）。

作者簡介趙蘇州（1988-），男，山東臨沂人，碩士研究生，研究方向：植物轉(zhuǎn)錄因子。*通訊作者，研究員，博士，從事植物基因沉默研究。

植物原生質(zhì)體是指植物細胞通過機械或酶解等特殊方法脫去細胞壁后，留下的裸露、具有生活力、被細胞膜所包圍的原生質(zhì)團。原生質(zhì)體由于沒有細胞壁，可相對容易攝取外源DNA、質(zhì)粒、病毒顆粒等外源遺傳物質(zhì)，是進行遺傳轉(zhuǎn)化的理想受體；同時，原生質(zhì)體也是獲得細胞無性系和選育突變體的優(yōu)良起始材料；還可通過誘導(dǎo)形成雜種細胞，為創(chuàng)造新雜種開辟了途徑。酶解法作為現(xiàn)在最常用的的方法，通過纖維素酶和離析酶將植物細胞裂解為均一的單細胞體系，能獲得完整和高活性的原生質(zhì)體[1-2]。純化后植物原生質(zhì)體可按既定方向進行培養(yǎng)，使原生質(zhì)體適合于遺傳轉(zhuǎn)化、細胞融合、生理研究、體胚發(fā)生、器官發(fā)生等操作[3]。因此，原生質(zhì)體的制備是其中最關(guān)鍵的一部，如何獲得完整且活性較高的原生質(zhì)體是各項工作的起始。在植物快速繁殖、植物遠緣遺傳重組、轉(zhuǎn)基因以及品種改良和創(chuàng)造新類型等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

原生質(zhì)體作為常用的植物瞬時表達系統(tǒng)，植物中瞬時表達系統(tǒng)具有檢測速度快、轉(zhuǎn)化簡單等特點，結(jié)合報告基因RFP、YFP、GUS[4]、GFP[5]、EGFP[6]等的使用，該技術(shù)被廣泛地用于基因功能分析的研究，如基因表達、蛋白亞細胞定位、染色質(zhì)免疫沉淀、蛋白活性檢測以及蛋白間互作等[7]。原生質(zhì)體瞬時表達系統(tǒng)相繼建立，為研究蛋白的亞細胞定位和基因的表達調(diào)控提供了方便而有效的試驗系統(tǒng)。玉米和擬南芥原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化體系可以對研究基因的功能和調(diào)控途徑的研究具有重要意義。筆者用玉米和擬南芥相互對照分離和純化，以期獲得高產(chǎn)接高活力的原生質(zhì)體，再通過PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的方法，成功建立玉米和擬南芥葉肉原生質(zhì)體較高效的瞬時表達系統(tǒng)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象。選取玉米（Zea mays L.）自交系宗31飽滿的種子，用10%過氧化氫消毒，用滅菌水沖洗3次置于發(fā)芽機，生長5 d，待胚芽長至約2 cm，移置營養(yǎng)土中，置于溫室培養(yǎng)1周左右，長至2葉期和3葉期，選取第2片伸展的葉子作為提取玉米原生質(zhì)體的材料。

1.1.2 主要試劑。氯化鈉、氯化鎂、氯化鈣、甘露醇、葡萄糖、MES、PEG 4000，購自Sigma公司；Cellulase R10和Macerozyme R10，均購自Japan Yakult Honsha， Tokyo；金牌超量無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒（Lot：00071309），購自北京康為世紀生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原生質(zhì)體的制備。擬南芥先用無水乙醇洗5 min，然后再用75%的乙醇加0.1%Triton100洗3 min，分別用95%乙醇再洗1遍，晾干后播種與1/2MS中，在溫度22 ℃/18 ℃光照14/10 h周期下7 d左右，移栽至營養(yǎng)土中，分別取到8～10片葉和12～14片葉期的擬南芥，取擬南芥葉片作為原生質(zhì)體。

1.2.2 質(zhì)粒提取。pCAMBIA1303表達框由花椰菜花葉病毒（CaMV）35S啟動子、GFP報告基因、胭脂堿合成酶終止子（NOS）構(gòu)成。按照說明書用康為世紀無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒抽提質(zhì)粒，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 酶解液配置。取0.5%～2.0%纖維素酶R10，05%～1.5%離析酶R10，0.3～0.6 mmol/L D甘露醇，20 mmol/L KCl，20 mmol/L MES（pH 5.7）混合液置于55 ℃水浴10 min，冷卻至室溫后，加入10 mmol/L CaCl2，0.1% BSA，并用0.45 μm濾膜過濾到培養(yǎng)皿中。

1.2.4 原生質(zhì)體制備和產(chǎn)量的測定。將玉米葉片和擬南芥葉片去兩端切成約0.5～1.0 mm細絲，把切好的葉片放入含有酶解液，室溫黑暗中振蕩（轉(zhuǎn)速為40 r/min）酶解（2～7 h）。顯微鏡下檢查溶液中的原生質(zhì)體，玉米葉肉原生質(zhì)體大小大約30～40 μm，擬南芥葉肉原生質(zhì)體大小大約30～50 μm。在過濾除去未溶解的葉片前用等量的W5[2 mmol/L MES（pH 5.7），154 mmol/L NaCl，125 mmol/L CaCl2，5 mmol/L KCl]溶液稀釋含有原生質(zhì)體的酶液。先用W5溶液潤濕35～75 μm的尼龍膜或60～100目篩子，然后用其過濾含有原生質(zhì)體的酶解液。將過濾后的綠色混合物置于40 ml圓底離心管中，400 r/min，2 min。洗滌沉淀1次，離心后棄上清液，再次加入W5，重懸沉淀，置于冰上30 min。再次400 r/min離心2 min，棄上清液，加入適量的MMg溶液（4 mmol/L MES，0.4 mmol/L D甘露醇，15 mmol/L MgCl2），備用。參考侯歲穩(wěn)的原生質(zhì)體簡易計數(shù)方法[8]。

1.2.5 PEG介導(dǎo)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和激光共聚焦顯微鏡檢測。吸取10 μg質(zhì)粒于2 ml圓底離心管中，加入制備好的100 μl原生質(zhì)體溶液混勻，原生質(zhì)體加入等體積30%～50% PEG-Ca2+溶液[PEG4000（m/v），200 mmol/L甘露醇，100 mmol/L CaCl2]，將混合物用2倍體積的W5溶液清洗2次，最后加入500 μl W5溶液置于室溫、弱光下培養(yǎng)15 h。轉(zhuǎn)化GFP融合載體的原生質(zhì)體培養(yǎng)過夜后用Leica激光共聚焦顯微鏡SP5觀測熒光分布[9-10]。

2結(jié)果與分析

2.1酶液濃度對原生質(zhì)體分離的影響 在含不同濃度組合的酶解液中黑暗裂解（擬南芥4 h，玉米6 h），其原生質(zhì)體的分離情況見表1。由表1可知，隨著酶濃度的不斷增加，玉米和擬南芥葉肉原生質(zhì)體的產(chǎn)量逐漸提高。當2種酶的濃度達到1.5%和0.5%以上后，原生質(zhì)體的產(chǎn)量增加不明顯。擬南芥中當兩種酶的濃度均達到1.5%以上后，原生質(zhì)體的產(chǎn)量逐漸減少，碎片也較多。玉米中情況稍微有點差別，在2種酶濃度均達到1.5%或2.0%，1.0%以上后，原生質(zhì)體產(chǎn)量逐漸減少，碎片也較多。因此，從原生質(zhì)體的產(chǎn)量、細胞碎片的多少及酶的使用量等多方面綜合考慮，擬南芥葉肉原生質(zhì)體分離的最佳的酶類組合為纖維素酶1.5%，離析酶0.5%，玉米原生質(zhì)體則有2個選擇，1個和擬南芥相同，產(chǎn)量較多，碎片少，另外纖維素酶2%，離析酶0.5%，產(chǎn)量最多，碎片稍微增多。

2.2酶解時間對原生質(zhì)體分離的影響 試驗比較了酶解2、3、4、5和6 h對擬南芥和玉米葉肉原生質(zhì)體分離效果的影響，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，隨著酶解時間的增加，原生質(zhì)體產(chǎn)量不斷提高，酶解4 h時，擬南芥原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，達（7.0±1.2）×105/ml，玉米則繼續(xù)增加，在6 h使玉米產(chǎn)量最高，達（6.0±2.1）×105/ml。當達到最大產(chǎn)量后，葉肉細胞已趨于完全解離，酶液中葉片成透明狀。酶解時間繼續(xù)增加，原生質(zhì)體產(chǎn)量反而下降。究其原因可能是由于長時間的酶解使一部分已解離的原生質(zhì)受到損傷進而解體的緣故。

2.4PEG濃度對原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的影響 PEG4000（聚乙二醇4000）分子能改變各類細胞的生物膜結(jié)構(gòu)，使2細胞接觸點處質(zhì)膜的脂類分子發(fā)生疏散和重組，原生質(zhì)體體表面的負電荷在鈣離子的連接下，形成靜電鍵，降低細胞表面的極性，促使之間粘著和結(jié)合，在高pH、高鈣離子的作用下，鈣離子和結(jié)合在質(zhì)膜上的PEG被洗脫，導(dǎo)致電荷平衡失調(diào)并重新分配，使2種原生質(zhì)體形成具有共同質(zhì)膜的融合體。由表4可知，試驗選用PEG4000對擬南芥葉肉原生質(zhì)休進行轉(zhuǎn)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在PEG4000濃度發(fā)生變化時，轉(zhuǎn)化效率也隨之發(fā)生變化。PEG濃度為20%時，擬南芥轉(zhuǎn)化效率僅有9%，隨著PEG濃度的升高轉(zhuǎn)化效率也隨之升高；當PEG濃度為40%時，轉(zhuǎn)化效率達到67%（圖1A）。玉米中在PEG濃度20%時轉(zhuǎn)化效率有17%，在30%和35%時轉(zhuǎn)化效率達到了45%左右（圖1B），且細胞碎片較少，PEG濃度在增加雖增加了轉(zhuǎn)化效率，但是細胞碎片開始增多。PEG的濃度越高，其對細胞的影響也越來越大，因為PEG對細胞有一定的毒害作用，高濃度下常致使細胞發(fā)生破碎。另外，PEG的物理化學(xué)性質(zhì)決定了其在較高濃度下（大于或等于50%）很難溶解，所以在較高濃度下不便于試驗操作。所以在轉(zhuǎn)化擬南芥和玉米原生質(zhì)體時，試驗選擇了40%和30%的溶液，以達到最好的效果。在培養(yǎng)16 h后用激光共聚焦顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)擬南芥轉(zhuǎn)化效率（67%）比玉米轉(zhuǎn)化效率（45%）高，細胞碎片比玉米少。

3結(jié)論與討論

酶解去壁對植物細胞是一個嚴重的機械損傷和生理損傷過程[11]。原生質(zhì)體適宜的分離條件要求既能將細胞壁完全去除，又要盡量減少對原生質(zhì)體的損傷。采用酶解法來游離煙草葉肉原生質(zhì)體時，試驗發(fā)現(xiàn)酶液的濃度、酶液的處理時間及其滲透壓等對原生質(zhì)體的產(chǎn)量及轉(zhuǎn)化活力等都有很大的影響。日本生產(chǎn)的纖維素酶（ Cellulase R10）和離析酶（M acerozyme R10）效果最佳，酶濃度經(jīng)過組合分析，發(fā)現(xiàn)擬南芥在1.5% Cellulase R10，0.5% Mecerozyme R10時裂解比較完全并且細胞碎片比較少，玉米在1.5% Cellulase R10，0.5% Mecerozyme R10時裂解也比較完全。在據(jù)以往的報道，滲透壓穩(wěn)定劑一般是用甘露醇、山梨醇、蔗糖或葡萄糖等，試驗過程中用甘露醇滲透壓穩(wěn)定劑， 結(jié)果是在擬南芥當甘露醇濃度為0.40 mol/L時原生質(zhì)體游離效果最為理想，玉米以濃度為0.45～0.50 mol/L的甘露醇做酶液的滲透壓穩(wěn)定劑時效果最理想。酶解處理一般靜置在黑暗中進行，擬南芥和玉米在未去表皮情況下酶解時間分別以4和6 h最佳，如果超過時間，原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化活力就會明顯降低，細胞碎片增多。

在質(zhì)粒轉(zhuǎn)化過程，PEG濃度對轉(zhuǎn)化效率和轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體狀態(tài)有很大的影響，擬南芥在40%或者45%濃度下可以獲得較高的轉(zhuǎn)化效率，玉米在30%可以獲得較高的轉(zhuǎn)化效率和保持穩(wěn)定的原生質(zhì)體。玉米原生質(zhì)體比擬南芥原生質(zhì)體容易皺縮破裂，玉米一般在16 h后就開始破裂，而擬南芥在4 ℃卻可以保持48 h以上還可以看到GFP。還有材料狀態(tài)、質(zhì)粒純度和培養(yǎng)過程，都會對轉(zhuǎn)化效率有很大影響。尤其是在雙質(zhì)粒轉(zhuǎn)化過程，需要較高的轉(zhuǎn)化效率，最后是用氯化銫超速離心法提取超純質(zhì)粒。酶解后的原生質(zhì)體失去了細胞壁的保護，極易受滲透壓變化的影響而導(dǎo)致破裂，因此在制備原生質(zhì)體的過程中，要保證酶解液等所用溶液的滲透壓盡量接近在玉米葉肉細胞自身的滲透勢，避免細胞吸水脹破或者失水皺縮；所有的操作過程都要輕柔，尤其是用移液槍吸取和離心速度要控制好，以防止因劇烈震蕩而導(dǎo)致原生質(zhì)體破裂；在原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化過程中，PEGCa2+濃度（玉米30%和擬南芥40%）、質(zhì)粒DNA純度，PEG誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化時間等是影響轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵因素。

參考文獻

[1] FROOZABADY E.Rapid plant regeneration from Nicotiana mesophyll protoplasts[J].Plant Sci，1986，46：127-131.

[2] SAXENA P K，GILL R.Plant regeneration from mesophyll protoplasts of the tree legume Pithecellobium dulce benth[J].Plant Sci，1987，53：257-262.

[3] CHU C C.Contributions of Chinese Botanists to Plant Tissue Culture in the 20 Cen tury[J].Acta Botanica Sinica，2002，44（9）：1075-1084.

[4] JEFFERSON R A，BURGESS S M，HIRSH D.betaGlucuronidase from Escherichia coli as a genefusion marker[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，1986，83（22）：8447-8451.